六味地黄丸中马钱苷、芍药苷、丹皮酚对肾上腺素诱导大鼠前脂肪细胞内cAMP的影响

冷 旺

（湖南中医药大学附属常德市第一中医院，湖南 常德 415000）

六味地黄丸含有丹皮酚、熊果酸、马钱苷等化学成分,但目前使用血清药理学来研究六味地黄丸的报道仅有几例，张宁等[1]进行了六味地黄丸血中入血成分的含量测定，确定了其含药血清中用高效液相色普仪可检测的马钱苷、丹皮酚等10种入血成分；提示这些有效成分可能为该方作用的物质基础,为进一步研究该方的作用及机理奠定了基础。在前期实验中，我们以血药浓度法作为手段，采用高效液相色谱技术对六味地黄丸含药血清进行了测定，发现马钱苷、丹皮酚、芍药苷等均为其主要入血成分，因此，在本研究中我们选用马钱苷、丹皮酚和芍药苷三个主要入血成分来研究其对大鼠前脂肪细胞内cAMP的影响。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康SD大鼠，清洁级，雌雄各半，体质量（200±20）g，由河南省实验动物中心提供。许可证号：SCXK（豫）2005-0001。

1.1.2 仪器 3K30型高速冷冻离心机（sigma公司产品）；UV-1600紫外分光光度计 （北京瑞利分析仪器公司产品）；佳能照相系统；XDS-1B体式倒置相差显微镜（日本Olympus）；Heracell型细胞培养箱 （德国贺利氏产品）；超净工作台（北京半导体设备一厂）；台式离心机（北京医用离心机厂）；恒温水浴箱（北京半导体设备一厂）。

1.1.3 药物与试剂 六味地黄丸（浓缩丸），由湖南省长沙市九芝堂制药有限公司生产，批号060361；马钱苷标准品购自河北医科大学药学院天然植物教研室；芍药苷、丹皮酚标准品购自中国药品生物制品研究所；肾上腺素，pH 7.2缓冲生理盐水（自制）；细胞培养液（DMEM/低糖）购自美国Hyclone公司,胎牛血清购自兰州民海生物有限公司，胰酶购自sigma公司，cAMP试剂盒购自上海中医药大学同位素室，其余试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 大鼠前脂肪细胞的培养 取雄性大鼠腹股沟部纯净脂肪颗粒，pH 7.2缓冲生理盐水(PBs)洗涤后剪成0.5～1 mm3大小均匀的小颗粒，以1 000 r/min离心10 min取上层的纯脂肪颗粒，轻轻地铺于经培养液润湿的培养瓶壁上。3～5 min后徐徐加入含20%胎牛血清的DMEM/低糖培养液5～10 mL，塞紧瓶塞，将底面翻转朝上。37℃、5%C02培养1～2 h，待黏附牢固后，翻转培养瓶做正常培养每日观察。原代培养区域性单层汇合达到约1/2瓶底面积后即可传代，取培养7代以内的大鼠前细胞用于实验。

1.2.2 分组及给药 取传代7代以内的细胞分为：空白对照组，马钱苷高、中、低剂量组，芍药苷高、中、低剂量组，丹皮酚高、中、低剂量组。其中马钱苷高、中、低剂量组的给药浓度分别为 5.0、10.0、20.0 μg/mL，芍药苷高、中、低剂量组的给药浓度分别为 3.0、6.0、12.0 μg/mL，丹皮酚高、中、低剂量组的给药浓度分别为8.0、16.0、32.0μg/mL。

1.2.3 细胞内cAMP水平的检测 取第六代大鼠前脂肪细胞,以2×105个/mL的浓度传于50 mL培养瓶中,置37℃、5%CO2培养至生长旺盛时,弃培养液,给药后分别培养48 h，收集细胞,用pH 4.75的醋酸缓冲液悬浮,调整浓度至106个/mL，取1 mL细胞悬液,1 500 r/min离心5 min,使细胞沉淀,弃去上清液,细胞沉淀加1 mL pH 4.75的醋酸缓冲液混悬,反复冻融3～4次,3 000 r/min离心15 min，取上清液100 mL按照药盒说明书进行测定。利用cAMP与125I-cAMP和特异性蛋白激酶竞争结合原理测定细胞内cAMP浓度,GC-1200r放射免疫计数器上测定放射性强度,从标准曲线上得出细胞内cAMP。实验数据以均数标准差“x±s”表示,方差齐者采用单因素方差分析方法,方差不齐者以秩和检验。细胞内cAMP水平检测见表1。

1.2.4 分组、给药 取传代7代以内的细胞分为：空白对照组、马钱苷组、芍药苷组、丹皮酚组、肾上腺素+空白对照组、肾上腺素+马钱苷组、肾上腺素+芍药苷组、肾上腺素+丹皮酚组。其中马钱苷组加入以增殖培养液配成的终浓度为10.0μg/mL的培养液进行培养，芍药苷组加入以增殖培养液配成的终浓度为6.0μg/mL的培养液进行培养，丹皮酚组加入以增殖培养液配成的终浓度为16.0μg/mL的培养液进行培养。含肾上腺素组每组各加入0.01 mL（即每毫升10%培养液加0.01 mL肾上腺素）（终浓度=加入的血清体积/总体积×100%）

1.2.5 细胞内cAMP水平的检测 取第6代大鼠前脂肪细胞,以2×105个/mL的浓度传于50 mL培养瓶中,置37℃、5%CO2培养至生长旺盛时,弃培养液,给药后分别培养48、72、96 h,收集细胞,用pH 4.75的醋酸缓冲液悬浮,调整浓度至106个/mL，取1 mL细胞悬液，1 500 r/min离心 5 min，使细胞沉淀,弃去上清液,细胞沉淀加1 mL pH 4.75的醋酸缓冲液混悬,反复冻融 3～4次，3 000 r/min离心 15 min， 取上清液100μL按照药盒说明书进行测定，利用cAMP与125I-cAMP和特异性蛋白激酶竞争结合原理测定细胞内cAMP浓度,GC-1 200 r放射免疫计数器上测定放射性强度,从标准曲线上得出细胞内cAMP。

1.3 统计学分折

2 结果

2.1 六味地黄丸中3种入血成分对大鼠前脂肪细胞内cAMP的影响

与空白组比较，马钱苷有显著性差异，其中以中剂量组的差异最为显著。提示马钱苷可使大鼠前脂肪细胞内的cAMP水平降低，且以中剂量组使其水平降低的较多。而芍药苷和丹皮酚虽没有显著性差异，但两者的中剂量组均使大鼠前脂肪细胞内的cAMP水平降低较多。六味地黄方3入血成分中剂量组均使大鼠前脂肪细胞内cAMP水平降低较明显，因此我们选用其中剂量作为最佳浓度来测定不同时间点肾上腺素诱导的大鼠前脂肪细胞内cAMP的水平，结果见表1。

表1 六味地黄丸3种入血成分对大鼠前脂肪细胞cAMP的影响

2.2 六味地黄丸3种入血成分对肾上腺素诱导的大鼠前脂肪细胞内cAMP水平不同时间点的影响

含肾上腺素空白组与不含肾上腺素空白组比较，在48、72、96 h 3个时间点均差异有统计学意义，提示肾上腺素空白血清可使大鼠前脂肪细胞内cAMP水平升高，且其对cAMP水平升高的促进作用随时间的延长而降低；各单体入血成分不含肾上腺素组与不含肾上腺素空白对照组比较，马钱苷组差异有统计学意义（P＜0.01），提示马钱苷可使大鼠前脂肪细胞内cAMP水平降低，且其对cAMP水平升高的促进作用随时间的延长而无明显的改变，表明马钱苷能降低前脂肪细胞内cAMP的水平，且随着时间的延长对细胞内cAMP的水平的影响无明显的变化；各单体入血成分含肾上腺素组与不含肾上腺素空白对照组比较，在48、72、96 h 3个时间点马钱苷差异无统计学意义（P＞0.05），提示含肾上腺素的马钱苷含药血清对大鼠前脂肪细胞内cAMP的水平无显著的影响，且随作用时间的延长而无明显变化。综上各实验表明：肾上腺素空白血清可使大鼠前脂肪细胞内cAMP水平升高，马钱苷是六味地黄方中降低细胞内cAMP水平的主要有效成分之一；由于马钱苷是六味地黄方中降低细胞内cAMP水平的主要有效成分之一，因此在拮抗肾上腺素使大鼠前脂肪细胞内的cAMP水平升高的作用的有效成分中，马钱苷起到一定的作用；通过在48、72、96 h 3个培养时间点的观察，马钱苷对细胞内cAMP水平的影响无明显的差异，因此，在培养48 h后可达到最佳作用，结果见表2。

表2 六味地黄丸3种入血成分对大鼠前脂肪细胞内cAMP水平的影响 （n=6）

3 讨论

中药复方药效物质基础研究目的在于以现代化学与药理学为基础，阐明复方的有效部位及有效成分，由于其所含成分的复杂性，导致中药复方药效物质基础的研究进展缓慢，从而使其作用机制、生物转化和代谢过程等系列研究也就成了无的放矢；药效物质基础不明确直接造成中药不能建立与国际接轨的质量标准，缺乏可靠的药理学、毒理学研究数据，俨然成为制约中药发展的“瓶颈”[2]。目前，绝大多数中药及复方仍然只能采用传统的口服给药的方式，口服中药后的血清中含有真正的有效成分，即原形成分、代谢产物及机体产生的应激性成分。因此，通过分析口服给药后血清中成分，确定中药及复方的体内直接作用物质，将成为快速、准确的研究确定中药药效物质基础的有效途径。1989年，日本学者田代真一提出了“血清药化学”的概念[3]。血清药物化学主要是研究血清中的化学物质，观测血清中外源性活性物质及其作用和代谢规律。王喜军等于1997年正式提出了“中药血清药物化学的概念及理论”，中药血清药物化学即是建立在中药有效成分形成、吸收和分布规律上的一种中药药效物质基础研究的理论和方法，他们利用此方法进行了六味地黄丸的血清药物化学研究，研究结果表明口服六味地黄丸后从血中发现了11个入血成分，其中4个为新产生的代谢产物；7个成分为六味地黄丸体外所含成分的原型，其中有一成分虽为熟地中所含原型成分，但其他2种药材也能代谢产生，对其体内的量变有共同的贡献[4]。本研究在此基础上对六味地黄丸中的部分有效组分群进行了追踪研究，确定了六味地黄丸含药血清中的3个原型入血成分：马钱苷、丹皮酚、芍药苷，因此在实验中我们选用以上3种成分来研究其对大鼠前脂肪细胞内cAMP的影响。

芍药苷为单萜苷类成分，马钱苷为环烯醚萜苷类成分，丹皮酚为酚类成分，这几种成分结构有一定的差别，但都为六味地黄丸中发挥免疫调节作用的主要物质基础。因此通过本实验了解这3种成分中有哪种或哪些成分能降低细胞内cAMP水平，从而进一步明确哪一类化合物可特异性结合细胞膜表面的受体，以揭示该化合物的作用机制。

六味地黄方（汤、丸、超微）含药血清中含有3种入血成分：马钱苷、芍药苷、丹皮酚，它们在阴虚病理状态下血清中3种成分的含量比正常状态下升高,且马钱苷、芍药苷、丹皮酚的含量都以超微最高，其次为丸剂、汤剂。本实验所得的结果：六味地黄方3种入血成分中只有马钱苷使细胞内cAMP水平降低，确认马钱苷为六味地黄方中降低细胞内cAMP水平的主要有效成分。因而提示六味地黄方在治疗阴虚病症时主要是通过马钱苷对cAMP系统改变是通过调节细胞内的环核苷酸系统而达到的。

早在上世纪50年代，Earl Sutherland首先发现，当肾上腺素结合到它的肝细胞表面受体时，细胞内cAMP水平升高。同时，当肾上腺素激动β受体，可促使细胞内cAMP水平升高。本研究也进一步证实了该结论，同时也发现马钱苷能拮抗肾上腺素使大鼠前脂肪细胞内的cAMP水平升高的作用。因此，通过本研究可以知道马钱苷可能是通过特异性结合细胞表面β受体，进而对大鼠前脂肪细胞内的cAMP水平产生影响。同时，本研究通过在不同时间点测定其细胞内cAMP水平，发现各个单体在3个时间点细胞内cAMP水平均没有明显变化，实验证明马钱苷是降低细胞内cAMP水平的主要有效成分，故在给药48 h后，药物作用效果已达到最大，无需进一步观察。

[1]张 宁，王喜军.六味地黄丸血中移形成分的含量测定[J].中药新药与临床药理，2004，15（3）：174-176.

[2]王喜军.中药及中药复方的血清药物化学研究[J].世界科学技术-中药现代化，2002，4(2)：1.

[3]李 萍，刘惠如，黄 涛.中药血清药物化学对中药现代化的意义[J]. 中国药业，2007，l6（2）：58.

[4]王喜军，张 宁.六味地黄丸的血清药物化学研究[J].中国天然药物，2004，2(4)，219-222.