盐酸青藤碱对家兔骨关节炎关节液IL-1β、PGE2生成与关节组织结构的影响

吴红娟，孙必强 ，朱传湘 ，邱赛红 *

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南省中医药高等专科学校，湖南 株洲 410005）

骨关节炎(Osteoarthritis OA)该病是以关节软骨的慢性退行性改变为核心，累及骨质，并包括滑膜、关节囊等多种结构的不同程度的炎性病变。是中老年人群常见病，最常发生于膝骨关节。在对于该病多种治疗方法中，关节腔内注射给药是相对见效快的方式之一。青藤碱是从治疗风湿关节病变的传统中药青风藤中提取的有效成分。其盐酸盐制成的注射液已获批准多年，临床主要采用肌肉注射方法治疗关节疼痛类疾病。近年来，一些临床医生根据各自的临床经验，将此注射液采用直接关节腔给药的方式治疗骨关节炎也取得了较好的临床疗效[1-2]。但其药理作用研究尚未见有报道。本文研究了以盐酸青藤碱关节腔注射对家兔骨关节炎关节液细胞因子IL-1β与PGE2的影响，并对关节组织进行了病理分析。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 大耳白家兔，由湖南中医药大学动物实验中心提供，试验动物使用许可证号：SYXK(湘)2009-0001。试验室内自动控制保持温度约23～25℃，湿度为60～70%。并定时排气、换气。

1.1.2 药物 盐酸青藤碱注射液，由湖南正清制药集团股份有限公司生产，含盐酸青藤碱25 mg/mL，批号0901404；玻璃酸钠注射液由山东正大福瑞达制药有限公司生产，批号200802181；醋酸曲安奈德注射液由上海通用药业股份有限公司生产，批号080501。

1.1.3 试剂 木瓜蛋白酶为SIGMA公司产品 （进口分装），购自湖南丽欣生物有限公司，批号：P3250；IL-1β放免试剂盒购自北京科美东雅生物技术有限公司；PGE2放免试剂盒购自苏州大学血栓研究所。

1.1.4 仪器 GC1500γ放射免疫计数器由科大创新股份有限公司中佳分公司生产。

1.2 方法

1.2.1 模型制备及分组 参照文献方法[3]，取健康大耳白家兔，体质量1.7 kg以上，雌雄兼用，正常饲养1周后投入实验。造模前测各动物右后膝关节直径、该关节最大活动度。除留作正常组的动物外，其余分别在第1、4、7天时给各兔的右后膝关节腔内注入4%的木瓜蛋白酶溶液0.3 mL进行造模。注射造模4周后，再次测造模关节的直径及活动度。根据造模关节的肿胀程度分层，随机分为5组：模型对照组、盐酸青藤碱注射液高、低剂量组、玻璃酸钠组、醋酸曲安奈德组。

1.2.2 给药方法 各组均采用对造模关节的关节腔注射给药，体积均为每次0.3 mL。正常组和模型组每3 d 1次注射生理盐水，盐酸青藤碱高、低剂量组按每3 d 1次注射盐酸青藤碱注射液7.5、3.75 mg，共给药3次。玻璃酸钠组为每5 d 1次，给药2次。醋酸曲安奈德组0.2 mg注射1次。第21天时对动物相关指标进行检测。

1.2.3 观察指标及方法 （1）关节的外观情况与活动 治疗中及结束时对关节外观及活动情况进行检查。（2）关节液炎性细胞因子检查 试验结束时，参照文献方法[4]，向所治疗关节的关节腔内注入生理盐水0.8 mL并反复回抽再注入3次后，抽取关节冲洗液。经2 000 r/min离心15 min，取上清液置-20℃保存。按试剂盒测试要求用放射免疫方法检测关节液中的PGE2、IL-1β含量。（3）膝关节组织病理学检查 用绞骨钳剪下所治疗膝关节，置于10%甲醛溶液中固定。经甲醛固定后标本分别经5%硝酸脱钙、乙醇脱水、二甲苯透明后石蜡包埋。取蜡块作膝关节中部矢状切片，制成5～6μm切片，HE染色后进行光镜下观察。观察内容包括软骨、滑膜细胞及滑膜下组织。根据Markin骨关节病组织分类方法[5]中关节软骨与滑膜病变计分标准，对各动物膝关节标本的病变程度进行计分和组间比较。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 兔关节活动情况的观察

造模前兔关节外观无肿胀，活动自如。造模后兔关节发生肿胀，表现为直径较造模前增加，活动受限。给药后，曲安奈德减轻关节肿胀的作用最明显，给药6 d即有效。盐酸青藤碱也有作用，但起效较曲安奈德组稍迟。玻璃酸钠对肿胀的影响不明显。各治疗组的关节活动度均优于模型组。其中曲安奈德和玻璃酸钠作用较明显，并较盐酸青藤碱起效快。

2.2 兔膝关节液中PGE2、IL-1β检测结果

关节液炎性细胞因子PGE2、IL-1β检测结果显示，正常组关节液中两种因子含量均低，模型组显著高于正常组。盐酸青藤碱、曲安奈德对关节液中PGE2、IL-1β含量均有显著降低的作用。玻璃酸钠降低PGE2的含量，但对IL-β含量的影响则不明显。盐酸青藤碱降低关节液IL-1β含量的作用不及曲安奈德，但较玻璃酸钠强。见表1。

表1 兔各组关节液中IL-1β与PGE2测定结果 （，n=8）

表1 兔各组关节液中IL-1β与PGE2测定结果 （，n=8）

注： 与正常组比较 *P＜0.05，**P＜0.01； 与模型组比较 #P＜0.05，##P＜0.01。 下同。

组别正常模型曲安奈德玻璃酸钠青藤碱1青藤碱2剂量(mg/关节)— —0.2 3 7.5 3.75 IL-1β（Pg/mL）446.89±213.25 1020.44±23.20**862.00±126.03##1011.42±42.76 896.72±149.77#850.83±181.14#PGE2（Pg/mL）226.50±13.46 285.04±16.41**243.5500±12.60#231.10±16.76##236.92±14.23##235.80±10.93##

2.3 兔膝关节病理组织学检查结果

光镜下观察显示，模型组动物软骨细胞排列不规则，表层软骨细胞缺损，滑膜的细胞增生和炎性细胞浸润明显。曲安奈德组滑膜炎症较轻，但软骨病变仍较明显，个别软骨层变薄。玻璃酸钠组软骨病变程度相对较轻，但滑膜及关节腔炎症较明显。其作用与模型组比较均有显著差异。两种剂量的盐酸青藤碱治疗均有减轻滑膜与关节腔炎症的作用，软骨的损伤破坏程度减轻，一定程度上兼有减轻滑膜与关节腔炎症及缓解软骨破坏的作用。其减少软骨病理积分与滑膜病理积分的作用与模型组比较均有显著性意义。结果见表2，图1。

表2 各组对木瓜蛋白酶致家兔骨关节炎模型膝关节软骨与滑膜病理积分的的影响（，n=6，分）

表2 各组对木瓜蛋白酶致家兔骨关节炎模型膝关节软骨与滑膜病理积分的的影响（，n=6，分）

组别正常模型曲安奈德玻璃酸钠青藤碱1 2剂量（mg/关节）— —0.2 3 7.5 3.75软骨病理积分0.33±0.51 6.50±1.22**5.16±0.75#3.83±1.16##4.50±1.04#4.16±0.98##滑膜病理积分0.16±0.40 8.50±1.37**2.83±1.16##6.33±0.81##3.83±1.16##3.33±1.21##

图1 盐酸青藤碱对兔膝骨关节炎模型治疗后关节组织病理检查光镜图（HE×100）

3 讨论

木瓜蛋白酶是一种水解酶，关节腔内注入木瓜蛋白酶所造成的骨关节退行性改变与临床非常相似[6]。在骨关节炎病理过程中，IL-1β和PGE2是参与对软骨与滑膜损伤的重要致病因子。研究证实，OA患者的关节液中可检测到高水平的IL-1，其中以IL-1β为主[7-8]。IL-1是介导关节软骨破坏最重要的细胞因子，能引发关节炎症，破坏软骨细胞。IL-1可促进滑膜细胞合成并释放PGE2、NO和胶原酶，产生强大的促炎作用，引起滑膜炎症[9]。还可促使软骨细胞产生前列腺素E2，加重关节的炎症反应，增加破骨细胞活性，促进骨吸收，与OA的发生、发展关系密切。PGE是滑膜炎症和关节疼痛的直接原因所在。故临床常以非甾体类抗炎药作为骨关节炎患者的对症治疗。

本研究证实了骨关节炎病变过程中有PGE2、IL-1β的参与。家兔骨关节炎造模后，关节液中PGE2、IL-1β的含量较正常动物明显增加。研究结果表明，盐酸青藤碱关节腔给药治疗后，病变关节中IL-1β和PGE2的含量下降，均较对照组有显著差异，表明盐酸青藤碱对骨关节炎病变过程中关节液IL-1β和PGE2的生成有抑制作用。关节液中这些细胞因子含量下降对缓解关节的病变具有积极的意义，有可能是其临床治疗骨关节炎有效的药理学基础。组织形态学检查结果显示关节滑膜与软骨的病理程度减轻，病变积分下降。大量研究已证实，盐酸青藤碱具有显著的抗炎和免疫抑制作用，盐酸青藤碱抑制骨关节炎兔膝关节液IL-1β和PGE2的生成的作用仍有可能与之有关，但具体的作用过程还尚待进一步研究。研究中还发现，在对兔膝关节液IL-1β和PGE2的影响中，玻璃酸钠主要降低PGE2的含量，曲安奈德降低IL-1β的作用更明显，而盐酸青藤碱对兔膝关节液IL-1β、PGE2含量均有一定的影响。这一结果也值得进一步的研究探讨。

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