4种金丝桃属植物基因组DNA提取及RAPD分析

周 凤，张东旭，吕洪飞

(1.山西大同大学农学与生命科学学院，山西大同 037009; 2.浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004）

4种金丝桃属植物基因组DNA提取及RAPD分析

周 凤1，张东旭1，吕洪飞2

(1.山西大同大学农学与生命科学学院，山西大同 037009; 2.浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004）

目的探究金丝桃属基因组DNA的提取方法及用RAPD分析的技术体系.方法采用改良的低pH值高盐法获得高质量的金丝桃属植物总DNA，从80个10-mer随机引物中筛选出12个，对4种金丝桃属植物的基因组DNA进行RAPD分析.结果共产生了330条DNA片段，其中218条谱带具有遗传多态性，约占66.1%.结论RAPD分析揭示4种金丝桃属植物之间的DNA指纹存在明显的种间差异，能为金丝桃属植物的分类鉴定提供遗传学依据.

金丝桃属 DNA提取 RAPD分析

金丝桃属(Hypericum L.)隶属藤黄科，全世界约400余种，我国约有8组55种8亚种，该属植物产于全国各地，但主要集中于西南地区[1].金丝桃属植物中含多种药用成分，如金丝桃素类、槲皮苷、金丝桃苷、芦丁、黄烷酮醇类、黄酮类、咄酮类、香豆素类和间苯三酚衍生物(贯叶金丝桃素)等[2].近年来的研究表明，金丝桃属植物所含金丝桃素类化合物具有抗抑郁、抑制中枢神经、抗病毒和增强免疫功能，并具有显著的抗DNA、RNA病毒作用，可用于艾滋病的治疗，从而引起医药界的重视[3].本课题组曾发现金丝桃属植物的叶表皮微形态[4]、叶内部的分泌结构类型、分布密度、大小和位置[3]以及红外光谱图[5]等存在较大差异，可用作金丝桃植物的鉴别指标，然而用分子生物学手段鉴别金丝桃属植物至今未见报道.

随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)是20世纪90年代发展起来的DNA分子遗传标记技术，已被广泛地应用在药用植物分类鉴别中[6-8].本研究试图以金丝桃属的4种植物为材料种，发展适于金丝桃属植物的总DNA提取方法及RAPD分析技术体系，以期为我国金丝桃属植物种类鉴定和优良栽培种选育提供基础数据.

1 材料与方法

1.1 植物材料

用于DNA提取的叶片采自浙江师范大学学校绿化科苗圃栽培的金丝桃属植物，分别是贯叶连翘(H.perforatum L)、小连翘 (H.erectum Thunb ex Murray)、元宝草 (H.sampsonii Hance)、浆果金丝桃(H. androsaemum Linn).

1.2 总DNA的提取

采用改良的低pH值高盐法，步骤如下:①取新鲜植物叶片约0.4 g，用70%酒精洗6 s，用蒸馏水清洗三次;②把洗净的叶片于研钵中快速用液氮研成粉末，将粉末转至1.5 mL离心管中;③加入1 mL预冷的提取介质 (100m mol／L pH 4.8 NaAc，50 m mol／L pH 8.0 EDTANa2，500 m mol／L NaCl，2% PVP，1.4%SDS，其pH为5.5);④置浮桥上65℃水浴保温40 min，其间颠倒混匀几次;⑤室温下12 000 r／min离心15 min，弃沉淀.⑥加入2/3体积的pH 4.8 2.5 mol／L Kac，混匀，0℃放置30min沉淀蛋白质，4℃12 000 r／min离心10～20 min，弃沉淀;⑦上清液加入0.6倍体积的-20℃预冷的异丙醇.温和混匀后于4℃沉淀核酸2 h;⑧4℃12 000 r／min离心20 min，收集沉淀;⑨用750μL无菌蒸馏水溶解沉淀，并于50℃水浴助溶;⑩4℃12 000 r／min离心10 min，弃不溶物.上清液中加入0.6倍体积异丙醇，1/10体积3mol/L NaAc(pH 5.2)，混匀后于12 000 r／min离心10 min收集DNA;（11）500 μL 70%乙醇洗涤沉淀.空气干燥5 min;（12）溶于50 μL 0.1×TE缓冲液中;（13）加3μLRNaseA混匀，并在37℃下保温30min，分装后存于4℃或-20℃备用.

1.3 总DNA的纯度检测

总DNA纯度和质量的检验采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检验和紫外吸收检验 (紫外分光光度计: Ultrospec 4000，UV/Visible Spectrophotometer)，测定提取总DNA样品A260、A280值.以A260/A280值估测其纯度，以公式:双链DNA浓度 (μg/μl)＝A260/ 0.020计算其浓度.

1.4 引物及其筛选

本试验所用的随机引物购自北京经科生物工程有限公司，包括第V组、第W组、第Y组和第Z组共80条引物，分别记为OPV-01至OPV-20，OPW-01至OPW-20，OPY-01至OPY-20，OPZ-01至OPZ-20.任取一个模板，对所有引物进行PCR扩增，根据扩增条带数的多少对引物做初步筛选，筛选原则是扩增条带数多且条带清晰的引物.

1.5 RAPD扩增反应

PCR反应在 GeneAmp PCR System 2400 (PerkinElmer Corporation)上进行，经预实验优化条件后确定反应体系总体积为25μL:10×PCR buffer (500 m m ol／L KCl，100 m m ol／L Tris-HCl， 1.0% TritonX-100)2.5μL，引物 (8 p mol／L)2μL，dNTP (dATP、dCTP、dGTP、dTTP各1 mmol/L)2.5μL，模板DNA 1.7μL(约含DNA 100 ng/μL)，MgCl2(25 mmol/L)2μL，Taq酶0.3μL(0.5 U/μL)，无菌水14 μL，反应混合物用16μL石蜡油覆盖.

扩增反应的程序为:94℃预变性5min，进入40个PCR循环 (94℃变性60 s，36℃复性60 s，72℃延伸90 s)，最后于72℃延伸5 min.取扩增产物8μL，加2μL上样缓冲液，用含有0.5μg/ m L溴化乙锭(EB)的1.4%琼脂糖凝胶电泳检测，以0.5×TBE为电极缓冲液，电压为5 V/cm，稳压电泳1.5 h.电泳结果在Pharmacia Biotech ImageMaster VDS系统下观察、照相记录结果.

1.6 数据统计分析

（2）民营企业融资难问题。民营企业在实际运行中，缺少强大的资金支持，以致于面临着生存危机。具体表现为：①银行贷款存在一定的限制。民营企业由于规模相对较小，可用于抵押的资产较少；同时缺少健全的财务制度，增加了破产风险，因此从银行贷款较难。②政策有失公平，民营企业缺少直接融资途径。当前国有企业占据市场主体，民营企业的融资渠道相对较少，融资成功几率较小。

根据扩增结果，计算多态位点百分率，按琼脂糖凝胶同一位置上DNA带的有无进行统计，有带(包括弱带)的记为“1”，无带的记为“0”.根据公式S＝Nxy/(Nx+Ny)计算不同样本之间的相似系数，其中S表示相似系数，Nxy为样本x和样本y共同具有的分子量相同的DNA扩增谱带数，Nx为样本x的DNA扩增谱带数，Ny为样本y的DNA扩增谱带数.各样本间的遗传距离P＝1-S.根据遗传距离并利用SPSS 13.0统计软中的Hierarchical Cluster Analysis方法(Clustermethod:Between-groups linkage; Measure:Interval(Euclidean distance))构建聚类图.

2 结果与分析

2.1 总DNA提取

紫外分光光度计测定的结果表明，提取的4个DNA样本的A260/A280值在1.85～2.0之间，均适合做RAPD分析，用0.8%琼脂糖凝胶电泳对4个DNA样本进行检测，只有个别样本有少许降解 (图1)，说明本研究所有DNA提取方法对金丝桃属植物是有效的.

图1 总DNA电泳图

2.2 随机引物的筛选和扩增结果

通过比较RAPD扩增效果，用贯叶连翘DNA样品对四组80个引物进行初步筛选，有48个引物可以得到较清晰扩增产物，然后用这48个引物对四种植物的DNA样品对48个引物复筛，得到12个多态性较高的引物.以这12条引物对4种植物DNA样品进行RAPD扩增，共获得330条扩增产物，每个引物的扩增条带为13～42条，平均为29.2条，其中218条具有遗传多样性，约占总数的66.1%，每个引物检测到的RAPD多态谱带不等，从10条到26条，平均为18.2条(图2、表1).这表明金丝桃属物种间个体间的DNA多态性是比较丰富的，因此，利用RAPD标记在DNA水平上检测金丝桃属种间差异是可行的.

2.3 金丝桃属种间聚类分析

根据12个引物得到的RAPD标记，在SPSS 13.0程序中计算任意两个物种间的Nei-Li遗传相似性系数(表2)，根据遗传相似性系数进行UPCMA聚类分析，构建遗传关系树状图(图2).

图2 引物OPW-01扩增产生的RAPD带型

表1 金丝桃属植物RAPD分析所用引物及其扩增结果

表2 金丝桃属不同物种之间的遗传相似系数

图3 金丝桃属4个不同样本RAPD分析聚类图

3 讨论

3.1 总DNA的提取

获得高质量的DNA样品是进行分子生物学研究的前提，DNA样品质量的好坏往往是分子生物学下一步实验成败的关键.目前植物基因组DNA的提取方法有CTAB法、SDS法及蛋白酶K法等.不同的植物材料，适合的提取方法也不同.造成这种现象的原因在于，不同的植物具有不同的细胞壁结构，细胞的内含物如酚类、多糖、帖类等次生代谢物质的含量差别很大.这些内含物可以与DNA结合形成复合物，DNA被埋在这种粘稠的胶状物中难以溶解，甚至产生不同程度的褐变.因此，对于不同的物种可能都需要寻找一套相应的最优提取方案，以获得高质量的DNA样品.

金丝桃属植物由于其组织细胞中含有大量的多酚、多糖及其它次生代谢产物[9]，如果提取方法选择不当，会使DNA埋在这种粘稠胶状物中而难以溶解[10]，从而干扰后续的操作.许多研究者发现，RAPD技术并非理论上所想象的那样“简便易行”.一些植物体内的特殊内含物和次生产物 (如单宁、脂质、多酚及色素类物质)直接影响Taq酶的活性，导致扩增失败.因此，针对富含多酚、多糖等物质的金丝桃属植物找出适宜的高纯度、大分子量DNA的高效提纯方法就显得十分必要.本研究分别用CTAB法、SDS法、普通高盐法和低pH值高盐法对金丝桃属四种植物叶片的总DNA进行了提取，结果发现CTAB法和SDS法不适于该属四种植物的总DNA的提取，基本上没有得到DNA，普通高盐法提取的总DNA纯度不够好，但低pH值高盐法很适合该属四种植物总DNA的提取，用该方法得到的DNA纯度较理想，OD260/280值都在1.85～2.0之间.用于RAPD扩增得到的结果也比较好.该方法提取DNA的得率高、试剂易得、步骤简单，不失为提取金丝桃属植物DNA的一种好方法.金丝桃属植物含多酚物质较多，高盐低pH值法采用pH 5.5的酸性提取液避免多酚类物质电离化及进一步氧化，同时利用PVP结合酚类物质;高浓度K+利于SDS与蛋白质及多糖形成复合物，复合物经离心或过滤除去.与CTAB法、SDS法相比，步骤少，材料损失少，另一方面，通过延长65℃水浴保温和第一次用异丙醇沉淀DNA的时间，可取得较高得率，按每克鲜重叶片计，所获得的DNA在1 500μg以上.高盐低pH法的优越性还在于，不采用酚、氯仿等有毒试剂，不需CTAB、SDS、酶等价格较高的试剂，技术环节容易掌握.

3.2 RAPD分析

RAPD技术原理简单，操作简便，是目前众多分子标记技术中应用最广的技术;但随着PCR条件的变化，会出现不同的扩增结果，且一些试验也发现RAPD反应的不稳定性[11].影响扩增的主要因子有DNA的模板含量和大小、Tsq酶含量、Mg2+浓度、dNTP浓度、热循环参数的设计及引物浓度等.

利用12个引物对4种金丝桃属植物的模板进行RAPD分析，研究了它们种间的遗传分化.共获得218条扩增稳定、重复性好的扩增带，反映出金丝桃属种间存在着丰富的遗传差异.从表2中我们得到金丝桃属四种植物的遗传相似性系数在0.095～0.190之间，可见这些种之间的遗传距离都比较远.相对而言，贯叶连翘与小连翘亲缘关系较近，元宝草与浆果金丝桃亲缘关系较近(图3).说明用RAPD技术鉴别金丝桃属植物的亲缘关系是可行的，这为进一步探究金丝桃属植物种属分类、物种起源等奠定了技术和理论依据.

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Genom ic DNA E xtraction and RAPD A nalysis of the F our S pecies in Hypericum Linn.

ZHOU Feng1，ZHANG Dong-xu1，LǖHong-fei2
(1.School of Agriculture and Life Sciences，Shanxi Datong University，Datong Shanxi，037009; 2.School of Chemistry and Life Sciences，Zhejiang Normal University，Jinhua Zhejiang，321004)

Objective To investigate genomic DNA extraction methods and the technical system of RAPD analysis in Hypericum Linn.Methods A low-pH and high-saltmethod to obtain high-quality total DNA of Hypericum Linn.，12 primerswere screened from 80 10-mer random primers，and were used to analysis genomic DNA of four species of Hypericum Linn.Results Generated 330 DNA fragments，218 bands ofwhich were polymorphic，accounting for about66.1%.Conclusion DNA fingerprints of four species had significant differences by RAPD analysis，these could provide genetic basis for taxonomic identifications of Hypericum Linn.

Hypericum Linn;DNA extraction;RAPD analysis

Q943

A

〔编辑 杨德兵〕

1674－0874（2010）04－0064－04

2010-04-06

周凤(1964-)，女，山西侯马人，硕士，副教授，研究方向:农业基础.