饲料中蛋氨酸HPLC检测方法的建立

卢志勇，高学军，黄建国，刘晓飞，李学琳

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

蛋氨酸是饲料中含硫氨基酸，在动物营养上有极大的价值。蛋氨酸的测定方法多种多样，主要有离子交换色谱法、氨基酸分析法、紫外分光光度法、高效液相色谱（HPLC）检测法等。但饲料在水解的过程中蛋氨酸会被部分氧化，离子交换色谱法、氨基酸分析法、紫外分光光度法无法准确测出蛋氨酸含量，而常规HPLC检测法在测定时只注重测定水解物中的蛋氨酸，也无法准确计算出蛋氨酸的含量[1]。本试验通过HPLC对蛋氨酸及蛋氨酸氧化物（蛋氨酸砜）进行柱前衍生，测定饲料中的蛋氨酸含量，从而提高对蛋氨酸检测的准确度，为今后饲料蛋氨酸的检测提供了一种准确可靠的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：SPD-10AV高效液相色谱仪（日本岛津生产）；N3000色谱工作站（浙江大学提供）；微型漩涡混合仪（上海精科实业有限公司生产）；KQ-500DE型数控超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司生产）；纯水仪（PALL公司生产）。

试剂：DL-蛋氨酸标准品（色谱纯，天津市光复精细化工研究所生产）；DL-蛋氨酸砜标准品（Alfa Aesar，Stock#B25094），其他试剂均为国产分析纯；Na2CO3-NaHCO3缓冲液（pH 9.0）；30 mg·mL-1CDNB 溶液（2,4-二硝基氯苯溶液）[2]。

1.2 色谱条件

C18不锈钢分离柱 YMC（5 μm 4.6×150 mm）；流动相：含φ＝30%乙腈的0.01 mol·L-1NaAC缓冲液（pH 5.2），取 0.01 mol·L-1pH 5.2 NaAC 缓冲液700 mL与色谱纯乙腈300 mL混合，经0.45 mm微孔滤膜真空抽滤，超声脱气；检测波长350 nm；柱温 25℃；流速 0.8 mL·min-1。衍生后的试剂经0.22 μm滤膜过滤后直接上样，体积10 μL，测定其中蛋氨酸含量。

1.3 样品液的准备

称取含蛋白质10～20 mg的试样（约50～100 mg，准确至 0.1 mg），按照 GB/T 18246-2000中酸水解法进行水解。水解后冷却，混匀，用40%的NaOH调pH到7.0，过滤，用三蒸水反复冲洗离心管和滤器，定容至50 mL，吸取1 mL滤液，待用。

1.4 蛋氨酸、蛋氨酸砜和氨基酸水解液的衍生

配置含蛋氨酸 2、5、10、20、40、60、80 μg·mL-1的蛋氨酸标准液各 1 mL[3]。分别置于 6个20 mL的离心管中，再分别加入pH 9.0 Na2CO3-NaHCO3缓冲液2 mL，混匀后，加入过量的CDNB（1：1.39），用微型漩涡混合仪混匀，置于 80℃ 恒温水浴锅中，避光暗反应 1 h，取出，冷却至室温，用 0.05 mol·L-1盐酸调 pH至 7.0，用三蒸水稀释至50 mL容量瓶中定容，混匀。蛋氨酸砜和氨基酸水解液处理步骤同上。

1.5 蛋氨酸含量计算

蛋氨酸的分子式为C5H11O2NS，蛋氨酸砜的分子式为C5H11NO4S，在试样水解过程中，蛋氨酸会部分氧化成蛋氨酸砜，由化学性质可以得出1 mol蛋氨酸氧化生产1 mol蛋氨酸砜，通过物质量的比可准确算出蛋氨酸的总量，见式（1）。

其中，m1为蛋氨酸砜的质量；m2为蛋氨酸的质量。

1.6 饲料蛋氨酸含量的测定

按一定比例将豆粕和玉米蛋白粉进行复配，通过益生菌发酵获得富含蛋氨酸饲料，称取50 mg，按照GB/T 18246-2000中酸水解法进行水解。

2 试验结果

2.1 蛋氨酸标准样品衍生后峰形的鉴别和标准曲线的建立

蛋氨酸标准品衍生液HPLC结果见图1，标准曲线见图2。

由图1可见，从左边起第 1个峰为CDNB在碱性条件下形成的DNP-OH，第2个峰为经CDNB衍生生成的DNP-蛋氨酸，为目的峰，出峰时间为9.788 min。以峰面积（μV.s）对进样浓度（μg·mL－1）所得作直线回归，获得回归方程Y=6169.9X-40468。在进样量为2～80 μg·mL-1的范围内，经重复进样，线性系数均在0.9839，在此范围内进样浓度峰面积呈良好的线性相关。

图1 60 μg·mL－1的标准品衍生液 HPLC 结果

图2 蛋氨酸标准曲线

2.2 蛋氨酸砜标准样品衍生后峰形的鉴别和标准曲线的建立

蛋氨酸砜标准品衍生液HPLC结果见图3，标准曲线见图4。

图3中从左边起第 1个峰为 CDNB在碱性条件下形成的DNP-OH，第2个峰为经CDNB衍生生成的DNP-蛋氨酸砜，为目的峰，出峰时间为8.463 min。获得回归方程 Y=2912.2X-10844，R2=0.9919。

2.3 饲料样品衍生图谱分析

饲料样品衍生液HPLC结果见图5。

由图5可知，8.472 min为蛋氨酸砜的目的峰，9.797 min为蛋氨酸的目的峰。结果表明，蛋氨酸和蛋氨酸砜衍生后目的峰分离良好，把峰面积代入标准曲线中，经计算可以准确的得出饲料中蛋氨酸总量。本试验选取饲料样品检测结果为每克饲料中含有蛋氨酸163.56 mg。

3 讨论

本试验对蛋氨酸和蛋氨酸氧化物（蛋氨酸砜）进行柱前衍生，并采用HPLC方法准确地测定了饲料氨基酸水解液中的蛋氨酸总量。目前有两种新型衍生剂6-氨基喹啉基-N-羟基-琥珀酰亚胺基甲酸酯（AOC）和 2,4-二硝基氯苯（CDNB）[4]。本试验选取新型衍生剂CDNB，不但价格便宜，易购得，而且能与蛋氨酸和蛋氨酸氧化物生成性质稳定的二硝基氯苯蛋氨酸和二硝基氯苯蛋氨酸砜，而过量的CDNB对试验无影响，线性关系良好。衍生后经HPLC C18柱分离，UV 350 nm检测，用含有φ＝30%乙腈的 0.01 mol·L-1NaAC 缓冲液（pH 5.2）为流动相，蛋氨酸和蛋氨酸砜与其他氨基酸分离良好。本试验研究了饲料中蛋氨酸含量的测定方法，较好地解决了蛋氨酸在酸性水解过程中易氧化难以测定的问题，提高了蛋氨酸测定的准确度，为测定饲料中蛋氨酸含量提供了新的方法。

[1]常碧影,阎惠文,张明,等.饲料氨基酸的测定国标研制[J].饲料工业,2000,21（2）:1-4.

[2]赵剑虹.柱前紫外衍生——高效液相色谱法测定血清和饮料中18种游离氨基酸[D].成都:四川大学,2006.

[3]黄建国,高学军,佟慧丽,等.HPLC测定饲料源小肽产品中赖氨酸含量[J].乳业科学与技术,2009（2）:78-80.

[4]Callejón R M,Tesfaye W,Torija M J,et al.HPLC determination of amino acids with AQC derivatization in vinegars along submerged and surface acetiWcations and its relation to the microbiota[J].Eur Food Res Technol,2007,227:93-102.