复方清热颗粒对大肠埃希菌外排泵影响的研究

韩 燕 卢加河

复方清热颗粒对大肠埃希菌外排泵影响的研究

韩 燕1卢加河2

目的观察中药复方清热颗粒剂对耐环丙沙星大肠埃希氏菌外排泵耐药机制的影响。方法建立急性耐环丙沙星大肠埃希菌腹腔感染兔模型，复方清热颗粒药液灌胃，空白对照组予等体积蒸馏水灌胃。末次给药心脏取血，离心分离出含药血清和空白血清。应用外排泵抑制剂(CCCP)选择出外排泵阳性的耐环丙沙星大肠埃希氏菌，应用琼脂对倍稀释法检测在有含药血清、空白血清、复方清热颗粒、泵抑制剂的情况下环丙沙星对上述7株大肠埃希氏菌的MIC值变化。结果中药复方清热颗粒含药血清不能明显降低环丙沙星对大肠埃希菌的MIC值。结论复方清热颗粒含药血清不能改善大肠埃希氏菌对环丙沙星的耐药情况。

大肠埃希氏菌 外排泵 复方清热颗粒 含药血清

1河北省沧州市中心医院(沧州061000)

2河北省沧州市人民医院(沧州061000)

随着抗生素的广泛应用，临床上出现了大量耐药菌株，大肠埃希菌是较常见的一种。大肠埃希菌的耐药机制主要有产生β－内酰胺酶、药物作用靶位的改变、外膜通透性的下降及主动外排活跃。细菌细胞膜上存在的各种药物外排泵在大肠埃希菌的耐药机制中起重要的作用，大肠杆菌是发现外排泵最多的一种细菌，在埃希大肠杆菌上发现了30多种外排泵，但一般认为AcrAB是最主要的外排泵。用基因敲除技术人工去除acrAB或tolC基因时，大肠埃希菌对上述药物的敏感性明显增加[1]。

1990年，革兰阴性菌泵抑制剂研制成功[2]。外排泵抑制剂具有减少耐药菌株的出现，逆转固有耐药和获得性耐药菌株耐药性的作用[3]，成为改善细菌耐药的希望之一。体外试验已经证明，多种质子泵抑制剂可以抑制铜绿假单胞菌、大肠埃希菌等外排泵，从而改善抗生素的抗菌活性，但因质子泵抑制剂对人体的毒副作用过大而不能应用于临床。实验经证明，中药复方清热颗粒可以抑制铜绿假单胞菌外排泵[4]。本研究继续观察中药复方清热颗粒对大肠埃希菌外排泵的影响。现报告如下。

1 实验材料

1.1 实验动物和菌株 实验动物为健康大耳白兔4只，体重范围2.0～2.5kg，购自北京科宇动物养殖中心;实验菌株为北京友谊医院临床分离菌株;质控菌株为ATCC25922。

1.2 主要试剂及耗材 环丙沙星购自拜耳公司;西黄耆胶购自广州南方化玻公司;复方清热颗粒(含败酱草、蒲公英、半枝莲等)由北京未名天人公司提供;碳酰－氰－间氯苯腙(CCCP)，购自Sigma公司;丙酮购自北京化工厂;血琼脂培养皿购自天津金章科技发展有限公司;M－H琼脂购自BD公司。

1.3 实验设备 电热恒温培养箱 DH6000AB型，天津市泰斯特仪器有限公司产;光电比浊仪，美国生物－梅里埃公司产。

2 实验方法与结果

2.1 含药血清的制备 兔适应性喂养1周，监测呼吸频率、心率、肛温及体重，并观察摄食情况。随机分为两组，模型组、空白对照组各2只，均禁食12h。模型组腹腔注射耐环丙沙星大肠埃希菌菌液，注射剂量2.5×109个/kg，4h后测肛温、血常规。体温 ＞39.5℃、白细胞总数 ＞13×109/L者入选。模型组动物均符合上述标准而入选。造模成功后每日分2次灌胃复方清热颗粒剂药液，剂量为22g/kg·d，连续5d。空白对照组予等体积蒸馏水灌胃，每日2次，连续5d。治疗结束后禁食12h，无菌心脏采血，3000转/s离心10min，制备含药血清和空白血清后同组混和，－20℃冰箱保存备用。

2.2 外排泵阳性大肠埃希菌的选择 选取临床分离的耐环丙沙星大肠埃希菌18株，各挑取单菌落平板划线接种于血琼脂培养皿中，36℃恒温培养箱中培养24h，再挑取单菌落，用蒸馏水稀释，比浊仪调节菌液至0.5麦氏浓度约108CFU/mL。同法配制ATCC 25922菌悬液作质控。配制含环丙沙星的琼脂平皿，质量浓度(μg/mL)分别为 0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256。细菌接种量约为105CFU。即采用琼脂对倍稀释法测出环丙沙星(CIP)对上述18株大肠埃希菌的MIC值[药物敏感试验的操作及结果的解释参照美国临床实验室标准委员会(CLSI)2006版标准]。抗生素对倍稀释琼脂培养基中加入CCCP，浓度为5μg/mL(CCCP浓度依据国内外文献对喹诺酮类药物与外排泵抑制剂相互作用的研究[5－6]，该浓度对外排泵有较好抑制作用，而对细菌生长无影响[7])。将18株大肠埃希菌菌悬液及质控菌株菌悬液接种于含有CCCP和环丙沙星的琼脂平皿上，接种量均为105CFU，36℃温箱中培养24h，测出在有CCCP的情况下环丙沙星对上述18株大肠埃希菌的MIC值。比较两组MIC值，如在有CCCP的情况下MIC值下降至原来的1/4或以下，即认为该菌株为外排泵阳性菌株[8](根据其原来MIC值大小分别命名为 E1 ～E7，见表 1)。

表1 应用CCCP前后CIP对外排泵阳性菌株MIC值的变化 (μg/mL)

2.3 外排泵阳性菌株的药敏结果 (1)含药血清和空白血清MIC值测定:配制20mL含药血清琼脂平皿，含药血清含量分别为0.5mL、1mL、2mL、4mL。接种上述7株大肠埃希菌菌悬液及质控菌株菌悬液于含药血清琼脂平皿中，细菌接种量约为105CFU，于36℃衡温箱培育24小时。各平皿7株大肠埃希菌均生长良好。未测出含药血清的MIC值。同样方法亦未测出空白血清的MIC值。(2)CCCP的MIC值测定:配制含CCCP琼脂平皿，CCCP 浓度(μg/mL)分别为 0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320。接种菌悬液于其中，接种量同上，于36℃衡温箱培育24h。各琼脂平皿上7株大肠埃希菌生长良好，未测出CCCP的MIC值。(3)空白血清+CIP组、含药血清+CIP组MIC值的测定:制备含空白血清和CIP的琼脂平皿，每个平皿中均加入空白血清 2mL，CIP 浓度分别为(μg/mL)2、4、8、16、32、64、128。接种菌悬液于琼脂平皿，并于36℃衡温箱培育24h。制备含含药血清和CIP的琼脂平皿，分为3组，每组CIP的浓度(μg/mL)均为2、4、8、16、32、64、128。3 组平皿中含药血清分别为 0.5mL、1mL、2mL。接种菌悬液于琼脂平皿，并于36℃衡温箱培育24h(CIP组、空白血清+CIP组、含药血清+CIP组MIC值比较见表2)。

3 讨论

大肠埃希菌细胞膜上的药物主动外排系统是导致大肠埃希菌对多种抗菌药物固有或获得性多重耐药的重要原因[9－10]，外排泵抑制剂在临床治疗中有较好的应用前景。

本实验观察到，CIP+空白血清组MIC值较西药组MIC值有所下降，但差异无统计学意义(P＞0.05)，说明空白血清不能明显改善铜绿假单胞菌对环丙沙星的耐药情况;CIP+含药血清组MIC值较西药组MIC值的差异亦无统计学意义(P＞0.05)，说明含药血清也不能明显改善大肠埃希菌对环丙沙星的耐药情况。

此前实验已经证明中药复方清热颗粒可以抑制铜绿假单胞菌的外排泵[4]，而本实验表明复方清热颗粒不能对大肠埃希菌外排泵有明显的抑制作用。通过这种相反的结果可以推断这两种外排泵外排环丙沙星的机制可能不同。本实验虽没有取得阳性结果，但也为外排泵抑制剂的研究提供了一些参考。

表2 应用空白血清、含药血清前后CIP对大肠埃希菌MIC值的变化 (μg/mL)

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The Experiment of Compound Clearing-Heat Granules on Efflux Pumps of Escherichia Coli

HAN Yan1， LU Jia－he2
1Cangzhou Central Hospital，Hebei Province(Cangzhou 061001)
2Cangzhou People's Hospital，Hebei Province(Cangzhou 061000)

Objective:To obseve the effect of compound clearing－heat granules on the mechanism of CIP－resistance Escherichia coli efflux pump.MethodsRabbit models were created by the acute CIP－resistant Escherichia coli abonomal infection.Those in the model group were given compound clearing－heat granules through stomache，while the normal group were given water in the same way and the same dose.After the last giving drug， the drug serum and blank serum were separated from heart blood.7 mutants of positive efflux pump CIP－resisitance Escherichia coli were selected by CCCP.The MIC of CIP adding drug serum，blank serum， compound clearing－heat granules and CCCP to those bacterials were measured by the agar dilution method.ResultsCompound Clearing－heat Granules serum can not decrease the MIC of CIP to Escherichia coli.Conclusions:The resistance of the efflux pumps with the peudomonas aeruginosa could not be increased by the compound clearing－heat granules.

Escherichia coli;efflux pump;Compound Clearing－heat Granules;Drug serum

R285.5

A

1004－745X(2010)09－1562－02

2010－01－17)