茶多酚和粉防己碱联合抗肿瘤药物对鼻咽癌耐药细胞株HNE-1（200）增殖的抑制作用*

王洪鹏 叶 琳 王 驰 陈鸿雁△

1 重庆医科大学附属第一医院（重庆 400016）

2 重庆医科大学药学院（重庆 400016）

茶多酚和粉防己碱联合抗肿瘤药物对鼻咽癌耐药细胞株HNE-1（200）增殖的抑制作用*

王洪鹏1叶 琳1王 驰2陈鸿雁1△

目的研究天然有效成分茶多酚（TP）和粉防己碱（TET）分别联合4种常见抗肿瘤药物对鼻咽癌耐药细胞株HNE-1（200）增殖的抑制作用。方法以鼻咽癌耐药细胞株HNE-1（200）为研究对象，用MTT法测定无毒剂量的TP和TET分别联合顺铂（DDP）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、长春新碱（VCR）、阿霉素（ADM）对实验细胞的增殖抑制率。结果无毒剂量的TP分别与4种抗肿瘤药物联合应用后，药物对HNE-1（200）细胞的抑制率增加约200%;无毒剂量的TET分别与4种抗肿瘤药物联合应用后，药物对HNE-1（200）细胞的抑制率增加约300%。结论无毒浓度的天然药物TP、TET分别与抗肿瘤药物联合应用能提高药物对鼻咽癌耐药细胞株的增殖抑制率，降低药物的IC50。

茶多酚 粉防己碱 鼻咽癌 HNE-1（200）细胞系 多药耐药

1 重庆医科大学附属第一医院（重庆 400016）

2 重庆医科大学药学院（重庆 400016）

*重庆市卫生局资助课题（No.2006-B-16）

△通讯作者

鼻咽癌我国南方常见的头颈部恶性肿瘤之一，化疗是临床治疗鼻咽癌晚期的主要方法之一，而多重耐药（MDR）的产生导致鼻咽癌细胞对化疗药物敏感性下降，严重影响了化疗的效果。大部分化疗药物和化疗增敏剂具有较大的毒副作用，未能广泛应用[1，2]。近年来，从天然药物中筛选出高效、低毒性的化疗增敏剂已成为研究热点。本研究选用天然有效成分茶多酚（TP）和粉防己碱（TET）检测其分别和4种常见抗肿瘤药物联合应用对鼻咽癌耐药细胞株的增殖抑制作用，为天然药物在头颈肿瘤化疗中的应用提供依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞系和培养条件：鼻咽癌耐药细胞株HNE-1（200）细胞株由重庆医科大学药学院王驰副教授提供，由人鼻咽癌细胞HNE-1经放射线诱导而来。细胞培养条件：含10%新生牛血清的RPMI-1640培养基中，37℃ 5%CO2饱和湿度条件下常规培养。（2）试剂：RPMI-1640培养基（GIBlo，美国）;新生牛血清（购自杭州四季青生物工程材料研究所）;粉防己碱（重庆医科大学药学院王驰副教授惠赠）;四甲基偶氮唑盐（MTT，购自北方同正生物制品公司）;DDP、5-Fu、VCR、ADM均为国产;TP为黄褐色粉末（含量60%，Sigma公司产品）。（3）仪器和设备：二氧化碳孵箱（美国LRBODEL）;超净工作台（苏州净化设备厂）;XSZ-D2倒置显微镜 （重庆光学仪器厂）;Model 450型酶标仪（美国BIO-RAD酶标仪）;Varian 600C型直线加速器 （美国）;光学显微镜（Olympus）。

1.2 方法 （1）MTT法测定抗肿瘤药物抑制HNE-1（200）耐药细胞株生长：取对数生长期HNE-1（200）耐药细胞稀释至（1.5～2）×105/mL，于96孔细胞培养板中培养1d，加药，继续培养4d，弃去培养液，每孔加0.5mg/mL的MTT 20μL培养液，培养4h，弃去培养液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，待溶解后用BIO-RAD Model 450型酶标仪于570nm处测吸光度值A570，并计算肿瘤细胞存活率，从而预测抗肿瘤药物对某种肿瘤细胞的抑制作用。肿瘤细胞抑制率（fa%）=[1-实验孔A570/对照孔A570]×100% 。（2）MTT法测定单独应用DDP、5-Fu、VCR、ADM对HNE-1（200）耐药细胞株的增殖抑制作用：处理组中加入不同浓度的DDP、5-Fu、VCR及ADM，对照组除不含抗肿瘤药物外其他条件完全一致。分组方法及浓度如下：DDP处理组设置A（0.25μg/mL）、B（0.5μg/mL）、C（1.0μg/mL）、D（1.5μg/mL）、E（3.0μg/mL）5个质量浓度水平。5-FU处理组设置 A（3.125μg/mL）、B（6.25μg/mL）、C（12.5μg/mL）、D（25.0μg/mL）、E（50.0μg/mL）5个质量浓度水平。ADM处理组设置A（1.25μg/mL）、B（2.5μg/mL）、C（5.0μg/mL）、D（10.0μg/mL）、E（20.0μg/mL）5个质量浓度水平。VCR处理组设置A（2.5μg/mL）、B（5.0μg/mL）、C（10.0μg/mL）、D（20.0μg/mL）、E（40.0μg/mL）5个质量浓度水平。（3）MTT法测定无毒剂量的TP、TET分别与4种化疗药物联合应用对HNE-1（200）耐药细胞株的抑制作用：TP、TET对实验细胞株无毒浓度筛选（方法参见文献[3]）。MTT法测定无毒剂量的TP、TET分别与4种化疗药物联合应用对HNE-1（200）耐药细胞株的抑制作用：实验组和对照组分别加入对细胞无直接损害作用的TP、TET浓度，与不同质量浓度的抗肿瘤药物联合使用（抗肿瘤药物的质量浓度不变），测定其HNE-1（200）耐药细胞株的增殖抑制率（方法参见参考文献[3]）根据线性方程计算其半数抑制浓度（IC50）值。1.3 统计学处理 应用SPSS 10.0统计软件。采用单因素方差分析，回归方程的建立采用直线回归法。

2 结果

2.1 单独应用DDP、5-Fu、VCR、ADM对HNE-1（200）耐药细胞株的增殖抑制作用 见表1。单独应用DDP、5-Fu、VCR、ADM对HNE-1（200）耐药细胞株的增殖抑制作用呈较明显剂量依赖关系（P＜0.05），细胞抑制率为6% ～65%。

表1 不同抗肿瘤药物对HNE-1（200）耐药细胞株的抑制作用 （%）

2.2 TP、TET对实验细胞株的无毒剂量筛选 见图1。经过MTT法测定，回归分析得出TP、TET对细胞抑制率小于10%时的药物质量浓度分别为0.15mg/mL、1.5μg/mL。以此质量浓度药物分别与HNE-1（200）细胞共同孵育，测定细胞的生长曲线，结果显示，加药组的生长曲线与对照组的生长曲线相近似（P＞0.05）。表明在此质量浓度下，TP、TET对细胞无毒性。

图1 TP、TET无毒剂量筛选结果

2.3 MTT法测定无毒浓度的TP、TET分别与4种化疗药物联合应用对HNE-1（200）耐药细胞株的抑制作用 见图2～图5、表2。TP分别与DDP、5-Fu、VCR、ADM联合应用对HNE-1（200）细胞的抑制率提高到19.01% ～79.66%，抑制率是单用抗肿瘤药物的120% ～300%;TET分别与DDP、5-Fu、VCR、ADM联合应用对HNE-1（200）细胞的抑制率提高至29.95%～81.96%，为单用抗肿瘤的126% ～400%。并且抗肿瘤药物浓度越小，两种天然成分的增效作用越强（P＜0.05），为进一步了解各组增殖抑制率，采用直线回归计算各组IC50值。从表2中可见联合用药组IC50均小于单用化疗药物（P＜0.05）。

图2 几种药物与顺铂相互作用对HNE-1（200）细胞抑制作用的影响

图3 几种药物与5-Fu相互作用对HNE-1（200）细胞抑制作用的影响

图4 几种药物与长春新碱相互作用对HNE-1（200）细胞抑制作用的影响

图5 几种药物与阿霉素相互作用对HNE-1（200）细胞抑制作用的影响

3 讨论

MDR是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生抗药性的同时，对其它结构和作用机理不同的抗肿瘤药物也产生交叉抗药性，其发病机制复杂，如何逆转MDR，提高药物对肿瘤细胞的增殖抑制率，是目前研究的一大难点。研究表明，联合用药是临床治疗恶性肿瘤的常用方法之一，化疗药物与化疗药物联合作用效果好，但由于毒副作用较大限制了其广泛应用[3，4]。天然药物具有不良反应少、毒性低的特点，在我国及其它亚洲国家广泛应用[5]，成为目前研究的热点。

表2 各实验组抑制HNE-1（200）细胞的IC50变化

TP是组成复杂的茶叶提取物，具有化疗增敏作用，冉铁成等[6]通过细胞实验，观察TP的剂量-效应关系，从而确证了茶多酚确有化疗增敏作用。但目前对TP的研究在头颈肿瘤较少见。

TET是是防己科植物粉防己的主要活性成分。资料表明粉防己碱具有多种生物学效应，在肿瘤防治等方面具有很好的应用前景。研究表明，粉防己碱能明显增强柔红霉素和长春新碱杀伤白血病细胞的能力，1.0×10-6mol/L的TET增加化疗药物DNR、VCR杀白血病细胞的作用为30%左右，并随着药物浓度的升高，促杀伤效应逐渐增强[7，8]。但是粉防己碱对鼻咽癌耐药细胞株作用报道较少。

本实验以采用MTT法检测了不同质量浓度的4种抗肿瘤药物DDP、5-Fu、VCR、ADM单用和分别联合无毒剂量的TP、TET对鼻咽癌耐药细胞HNE-1（200）的增殖抑制作用，试图发现单独用药和联合两种天然化疗增敏剂对鼻咽癌耐药细胞株的作用特点。结果显示，单用化疗药物，细胞抑制率在6%～65%之间，抑制作用呈剂量依赖关系;化疗药物联合应用无毒剂量的TP后，细胞抑制率提高到11% ～79%，约为单独用药的122%，联合用药IC50下降至单独用药的1/2左右;化疗药物联合应用无毒剂量的TET后，细胞抑制率提高到20%～85%,为单独用药的约131%，联合用药IC50下降至单独用药的1/2～1/3左右。单抗肿瘤药物质量浓度越小时，联合两种天然有效成分的化疗增敏作用越明显，提示较小剂量的抗肿瘤药物联合天然成分具有较明显的减毒增效作用。

综上所述，本实验初步显示天然有效成分TP和TET在体外对鼻咽癌耐药细胞具有较好的化疗增敏作用，提示临床鼻咽癌晚期化疗可采用抗肿瘤药物联合应用一种或多种天然有效成分以提高治疗效果，这对提高晚期鼻咽癌患者5年生存率及其生活质量都具有一定的意义，同时也为TP和TET作为化疗增敏剂的进一步研究和应用，提供了试验室依据。

[1]Fu LW，Deng ZA，Pan QC.et al.Screening and discovery of novel MDR modifiers from anturally occurring bisbenzylisoquinoline alkaloids[J].Anticancer Res，2001，21（4A）：2273 ～ 2280.

[2]Choi SU，Park SH，Kim KH，et al.The bisbenzylisoquinolineal alkaloids tetrandine and fan gchinoline，ehance the cytotoxicity of multidrug resistance related drugs,Aamodulation of P-glycoprotein[J].Anticancer Drugs，1998，9（3）：255.

[3]Gottesman MM，Pastan L，Ambudkar SV.P-glycoprotein and multidrug resistance[J].Curr Opin Genet Dev，1996，6（5）：6 ～10.

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[5]王天晓，张凤春，杨晓虹.敏药碱-G逆转肿瘤细胞多药耐药的作用和机制研究[J].中国药理报,2005，21（5）：184～186.

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[7]许文林，敖忠芳，陈玉心，等.汉防己甲素对柔红霉素和长春新碱增效作用的实验研究 [J].中华血液学杂志，1994，15（5）：256～257.

[8]许文林，敖忠芳，陈宝安，等.汉防己甲素逆转血液系统肿瘤细胞多药耐药的临床研究[J].中华内科杂志，2001，40（9）：631～633.

Study of the Inhibitive Effects of Tea Polyphenols and Tetrandrine Combined with Antineoplastic Drugs on the HNE-1（200）Cell Line

WANG Hong-peng1,YE Lin1,WANG Chi2,et al
1 The First Affiliated Hospital,Chongqing Medical University（Chongqing 400016）
2 Chongqing Medical University（Chongqing 400016）

Objective:To obverse the inhibitive effects of tea polyphenols and tetrandrine apiece combined with 4 kinds of antineoplastic drugs on the HNE-1 （200）cell line.Methods:MTT method was used to determine the inhibitory proliferation effects of non-toxic dose tea polyphenols and tetrandrine apiece combined with DDP,5-Fu,VCR and ADM on HNE-1（200）cell line.Results:Non-toxic dose tea polyphenols combined with 4 kinds of antineoplastic drugs could increase the inhibitory rate to 200%.Non-toxic dose tetrandrine could increase it to 300%.Conclusion:Non-toxic dose tea polyphenols and tetrandrine apiece combined with antineoplastic drugs can increase the inhibitory rate of it on HNE-1（200）cell line and decline IC50of antineoplastic drugs.

Tea polyphenols;Tetrandrine;Nasopharyngeal carcinoma;HNE-1（200）cell line;Multidrug resistance

R285.5

A

1004-745X（2010）01-0102-03

2009-08-09）