UFLC法同时测定防己中粉防己碱和防己诺林碱的含量

朱鹤云 ， 费 雪 ， 孙宇慧 ， 王黎明 ， 郝乘仪 ， 冯 波 ， 关 皎

(吉林医药学院药学院 ， 吉林 吉林 132013)

UFLC法同时测定防己中粉防己碱和防己诺林碱的含量

朱鹤云 ， 费 雪 ， 孙宇慧 ， 王黎明 ， 郝乘仪 ， 冯 波 ， 关 皎

(吉林医药学院药学院 ， 吉林 吉林 132013)

为了建立超快速液相色谱法(UFLC)同时测定防己中粉防己碱和防己诺林碱的含量，为防己药材的质量控制提供参考。方法：采用Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm × 3.0 mm,2.2 μm)；以乙腈-0.2%磷酸水(三乙胺调pH值至8.0)(65∶35,v/v)为流动相；流速为0.8 mL/min；检测波长为282 nm；柱温为30 ℃。结果：粉防己碱和防己诺林碱分别在10-500 μg/mL(R = 0.999 9)和10-500 μg/mL(R = 0.999 9)浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系；平均回收率(n= 9)分别为98.0%和99.1%。表明该方法结果准确、操作简便、具有良好的重现性和稳定性，可用于防己药材的质量控制，同时为新兽药开发利用提供参考。

防己 ； 粉防己碱 ； 防己诺林碱 ； 超快速液相色谱法

防己为防己科植物粉防己Stephania tetrandra.S.Moore.的干燥根[1]，性苦，寒，归膀胱、肺经，具有利水消肿、祛风止痛之功效[1]。防己中的主要化学成分为生物碱，其中粉防己碱和防己诺林碱为主要活性成分，2015年版《中国药典》将粉防己碱和防己诺林碱作为防己药材质量控制的主要指标。目前，文献报道的防己的质量控制方法主要包括毛细管电泳法[2]、化学发光法[3]和高效液相色谱法[4-6]。然而，这些方法存在专属性差、流动相组成复杂、分析时间长、样品处理复杂等缺点。近年来，超快速液相色谱(Ultra-fast liquid chromatography,UFLC)技术由于在峰容量、分析效率、灵敏度和分辨率方面均优于常规 HPLC，并可在极短的时间内达到柱平衡或重新平衡，显著减少分析时间，同时相应会减少溶剂消耗，已越来越多的应用于中药成分分析研究[7-8]。本研究首次采用超快速液相色谱法测定防己中粉防己碱和防己诺林碱的含量，所建立的定量分析方法分析时间短，分析效率明显提高，可为防己的质量评价提供科学依据，同时为天然药物应用于兽医兽药领域提供参考。

1 仪器与试药

Prominence UFLC型超高快速液相色谱仪(配备Prominence SIL-20AHT自动进样器，LC-20AD二元泵，CTO-20A柱温箱，SPD-20A紫外检测器，LC solution色谱工作站，日本岛津公司)；KQ-250DE型数控声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；CPA 225D型电子天平(德国赛多利斯仪器有限公司)；万能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)。

乙腈、甲醇均为色谱纯(美国Fisher科技)，所用水为经过Milli-Q型超纯水仪净化后的超纯水，其他试剂均为分析纯。对照品粉防己碱(批号：110711-201609)和防己诺林碱(批号：110793-201606)，购自中国食品药品检定研究院，纯度均大于98%。

防己药材购自吉林市吉林大药房，产地为江西省，经吉林医药学院生药教研室李景华副教授鉴定为防己科植物粉防己Stephani0atetrandra.S. Moore.的干燥根，样本留存于吉林医药学院药学院中药样品室。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的配制 分别精密称取对照品粉防己碱、防己诺林碱对照品适量，置于5 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，制成含粉防己碱 1 mg/mL、防己诺林碱1 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 取防己药材粉末(过40目筛)约0.5 g，精密称定，置50 mL锥形瓶中，加入70%甲醇25 mL，称定重量，超声提取30 min，放冷后再称重，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。取续滤液经0.45 μm微孔滤膜过滤后作为供试品溶液。

2.3 色谱条件 采用Shim-Pack XR-ODS色谱柱(75 mm×3.0 mm,内径: 2.2 mm)，预柱为C18保护柱(4 mm×3.0 mm, 内径:2.2 mm)，流动相为乙腈-0.2%磷酸水(三乙胺调pH值至8.0)(65∶35,v/v)，流速为 0.8 mL/min；检测波长为282 nm；柱温为30 ℃，进样量5 μL。色谱图见图1。

图1 混合对照品(A)、样品(B)色谱图1：防己诺林碱(fangchinoline); 2：粉防己碱(tetrandrine)

2.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.1”项下的粉防己碱和防己诺林碱对照品溶液适量，置于同一5 mL容量瓶中，用甲醇-水(70∶30,v/v)配制成粉防己碱和防己诺林碱浓度均为10,20,50,100,200 μg/mL和500 μg/mL的系列混合对照品溶液，依次注入液相色谱仪，测定色谱峰面积，以所含对照品的浓度X(μg/ml)为横坐标，色谱峰面积积分值(Y)为纵坐标，进行线性回归，粉防己碱和防己诺林碱的回归方程分别为：

Y=3.329×103X+1.834×104R=0.999 9

Y=5.005×103X+7.773×104R=1

结果表明，粉防己碱、防己诺林碱浓度分别在10-500 μg/mL、10-500 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 分别精密吸取“2.4”项下制备的第4混合对照品溶液5 μL，按上述色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果粉防己碱、防己诺林碱峰面积的RSD(n=6)分别为0.4%和0.4%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一批次的供试品溶液，放置于室温，分别于0，2，4，8，12，24 h进样测定，记录峰面积。结果粉防己碱、防己诺林碱峰面积的RSD分别为1.6%，0.2%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验 取同一批防己样品6份，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样5 μL，计算粉防己碱、防己诺林碱的含量，结果上述2种成分的含量的平均值(n=6)分别为0.40%和1.42%；RSD分别为2.3%和0.6%，表明方法重复性良好。

2.8 回收率试验 精密称取已知含量(粉防己碱和防己诺林碱含量分别为0.40%和1.42%)的防己样品粉末9份，每份0.25 g，精密称定，分别加入相当于样品中粉防己碱和防己诺林碱含量的80%，100%，120%的对照品溶液适量，各3份。按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，进样5 μL测定，计算粉防己碱和防己诺林碱的回收率和RSD，结果见表1。

表1 防己样品中粉防己碱和防己诺林碱的回收率

2.9 样品含量测定 精密称取6批防己样品粉末，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样5 μL，计算粉防己碱和防己诺林碱的含量。6批样品测定结果见表1。

表2 防己样品中防己碱和防己诺林碱的含量(%，n=6)

3 讨论

3.1 流动相的优化 分别考察了乙腈-0.2%磷酸(三乙胺调pH值至8)、甲醇-0.2 mol/L乙酸铵-0.1%甲酸水溶液、乙腈-甲醇-水-冰醋酸(40∶30∶30∶1)(每100 ml含十二烷基磺酸钠 0.41 g)和乙腈-0.2 mol/L乙酸铵-0.1%甲酸水溶液共4种流动相体系，结果表明，乙腈-0.2%磷酸(三乙胺调pH值至8)作为流动相时能够获得较好的分离效果，分析时间为3 min，与文献[7-9]中采用常规HPLC相比分析时间明显缩短，且药材中其他色谱峰不干扰样品的测定，适合于防己药材的高通量分析。

3.2 检测波长的选择 采用二极管阵列检测器(DAD)进行全波长扫描，粉防己碱和防己诺林碱在282 nm和215 nm处有最大吸收，其中215 nm 波长处靠近末端吸收,干扰较大。综合考虑杂峰影响，基线平稳，色谱峰峰形，最大吸收等因素，本试验选择282 nm作为检测波长。

3.3 提取方法及提取溶剂的选择 本试验对比了回流法和超声法提取防己中粉防己碱和防己诺林碱的提取效果。结果表明，超声提取30 min所得供试品中上述两种活性成分的含量明显高于回流提取法。本试验对比了50%、70%、100%乙醇溶液和50%、70%、100%甲醇溶液对防己中2种活性成分的提取效率，结果显示，70%甲醇的综合提取效率最高，故本试验采用70%甲醇作为提取溶剂。

3.4 本研究建立UFLC法同时测定防己中粉防己碱和防己诺林碱的含量，并应用该方法测定了6批防己中上述2种活性成分的含量。购自吉林大药房的6批防己均符合药典要求(药典规定防己中含粉防己碱和防己诺林碱的总量不得少于1.60%)。本研究建立的分析方法简单、快速、重复性好，可用于防己药材的质量控制。

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典: 2015 年版一部[S]. 北京: 中国医药科技出版社，2015: 148-149.

[2] 李玉琴，陈兴国，齐永秀，等. 非水毛细管电泳法测定防己及其制剂中防己诺林碱和防己碱的含量[J]. 中国中药杂志，2007,32 (19): 1 992-1 995.

[3] 许雪琴，欧海玲，王渊福，等. 化学发光法测定防己中的防己诺林碱[J]. 福州大学学报(自然科学版)，2008,36 (5): 763-766.

[4] 刘永刚，刘勇，何瑞杰，等. HPLC测定防己中防己诺林碱和粉防己碱的含量[J]. 中国实验方剂学杂志，2010,16 (9): 49-51.

[5] 侯丽丽，晏永新，张丽. HPLC法测定复方防己口服液中粉防己碱和防己诺林碱的含量[J]. 中国兽药杂志，2013,47(2): 24-26.

[6] 黄泽春，王益群. 高效液相色谱法测定防己药材中粉防己碱与防己诺林碱的含量[J]. 中南药学，2008,6(5): 541-543.

[7] 赵万里，许文，丘建芳，等.UFLC同时测定泽泻中6种三萜类成分含量[J]. 中国实验方剂学杂志，2015,21(1): 64-68.

[8] 关皎，朱鹤云，冯春，等.超快速液相色谱法同时测定车前子中京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的含量[J]. 中国实验方剂学杂志，2015,21(1):64-68.

SimultaneousdeterminationoftetrandrineandfangchinolineinStephaniatetrandraS.MoorebyUFLC

ZHU He-yun , FEI Xue , SUN Yu-hui , WANG Li-ming , HAO Cheng-yi , FENG Bo , GUAN Jiao

(College of Pharmacy, Jilin Medical University， Jilin 132013, China)

To establish an ultra-fast liquid chromatography (UFLC) method for simultaneous determination of tetrandrine and fangchinoline inStephaniatetrandraS. Moore. Chromatographic separation was performed on Shim-Pack XR-ODS column (75 mm × 3.0 mm,2.2 μm). The mobile phase was acetonitrile-0.2% phosphate acid (triethylamine adjust pH to 8.0)( 65: 35,v/v) and the flow rate was 0.8 mL·min-1.The detecting wavelength was set at 282 nm and column temperature was maintained at 30 ℃. The linear ranges were 10-500 μg·mL-1(r=0.999 9) for tetrandrine and 10-500 μg·mL-1(r=0.999 9) for fangchinoline. The average recovery (n=9) of tetrandrine and fangchinoline were 98.0% and 99.1%,respectively. The developed method is simple,accurate with high repeatability and stability,which is suitable for the quality control ofStephaniatetrandraS. Moore.,and can provide references for the development and utilization of new veterinary drugs.

StephaniatetrandraS. Moore ; Tetrandrine ; Fangchinoline ; UFLC

GUAN Jiao

R917

A

0529-6005(2017)08-0091-03

2017-04-24

吉林市科技局杰出青年基金项目(20166031)；吉林市科技局杰出青年基金项目(20166029)

朱鹤云(1982-)，男，讲师，博士，研究方向为中药质量控制及药代动力学，E-mail:zhy19820903@126.com

关皎，E-mail：rainbowguanjiao@sina.com