基质金属蛋白酶-3(MMP-3)5A/6A基因多态性与多发性硬化相关性研究

李传斌, 卢 宏, 张深义, 赵伟丽

多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种病因未明的中枢神经系统自身免疫性脱髓鞘疾病。流行病学调查结果提示,遗传因素可能在 MS发病机制中起作用。基质金属蛋白酶在中枢神经系统(CNS)疾病的炎症反应中有很强的破坏作用,通过攻击脑血管的基底膜和破坏血-脑屏障(BBB),导致脑实质的损伤,并对神经元有不同程度的毒性作用。基质金属蛋白酶-3(MMP-3)启动子 5A/6A基因具有多态性[1],检测这种多态性对某些疾病的遗传易感性及免疫调控的研究有重要意义。为了解 MMP-3启动子基因 5A/6A多态性与 MS相关性的关系,本研究用聚合酶链式反应(PCR)-连接酶检测反应(LDR)的基因分型技术检测了 51例 MS患者及 55例正常人 MMP-3启动子 5A/6A基因的基因型和等位基因频率,以探讨这些基因与河南省人群中 MS遗传易感性的可能关系。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 临床资料 研究对象均为河南地区汉族人,饮食结构相似,各研究对象之间无血缘关系。所有研究对象均除外糖尿病、恶性肿瘤、肝肾功能不全、甲状腺疾病、接受器官移植、严重营养不良等疾病。全部受试对象均取得知情同意。MS组:共 51例,为 2002年 5月 ～2007年 11月间在郑州大学第一附属医院神经内科住院的或出院后定期门诊随访的临床确诊或实验室支持确诊的 MS患者,诊断均符合 poser标准。其中男性 19例,女性 32例,年龄14～69岁,平均 39.05±14.31岁,均经 2名以上神经内科专家诊断,符合 Poser等制定的临床确诊(definite)或实验室支持确诊的 MS诊断标准。分型情况:复发缓解型 39例,进展复发型 1例,原发进展型 2例,实验室支持确诊 9例(包括视神经脊髓炎 3例)。其中活动期患者 33例,稳定期患者 18例。对照组:55例,男性 29例,女性 26例,年龄 20～56岁,平均 34.31±10.71岁,均为河南汉族人,由河南省红十字会献血中心的健康献血者中随机抽取。两组间性别、年龄差异无显著意义。

1.1.2 实验材料 PCR引物序列合成:上海翼和应用生物技术有限公司根据生物软件 oligo6.0设计;Taq酶体系(酶 5U/μl,德国 Qiagen公司);dNTP(2mM/each美国 RKOMEGA公司)。

1.2 方法

1.2.1 标本基因组 DNA的提取 采用酚氯仿法,从外周静脉全血中提取人全基因组 DNA。(1)采血:采取每例患者和正常对照组外周静脉全血3ml加入 EDTA抗凝管中,立即放入 -20℃冰箱中冷冻保存;(2)编号;(3)取 600μlEDTA抗凝全血加入1ml EP管中;(4)取红细胞(RBC)裂解液(德国 BAG公司)900μl,加入 EP管中盖好上盖,分别摇动 30～40次;(5)放入离心机 6000r/min离心 45s,弃去上清;(6)再次加入红细胞裂解液 600μl加入 1ml EP管中,盖好盖子,分别摇动 30～40次;(7)放入离心机 6000r/min离心 45s,弃去上清;(8)加入白细胞(WBC)裂解液 400μl,盖好上盖,放在振荡器上振荡均匀;(9)打开上盖,加入冰冻无水乙醇 1000μl,盖好上盖,轻轻颠倒均匀,可见絮状 DNA沉淀;(10)吸取絮状 DNA加入到另一标好相应编号的 1ml EP管中;(11)加入 75%乙醇 1000μl盖好上盖摇动几次;(12)放入离心机中 6000r/miin离心 2min,打开上盖,轻轻弃去上清,打开上盖在吸纸上轻叩吸去残留的乙醇;加入 400μl蒸馏水,轻轻弹动使沉淀的 DNA充分溶解,抽样紫外分光光度法测定 DNA浓度为0.14μg/ml;(13)放入 4℃冰箱中过夜保存备用。

1.2.2 MMP-3启动子 5A/6A基因检测 上游引物序列为 5'-ACATGGGTCACGGCACCT-3',下游引物序列为 5'-GTGGCCAAATATTTTCCCTGT-3';PCR体系总体积为 20μl,其中包括 DNA模板 1μl,2mmol/LdNTP 2μl,1 ×PCR缓冲液 2μl,上、下游引物各 0.2μmol/L,1u/ul TaqDNA聚合酶 0.2ul。PCR反应条件为 95℃预变性 15min,然后于 94℃ 30s、56℃ 60s、72℃ 60s,共 35个循环,再于 72℃延伸7min。PCR扩增后用 3%琼脂糖凝胶电泳检测是否有特异性的扩增产物。

1.2.3 连接酶检测反应(LDR)及测序仪电泳对人全基因组 DNA模板获得的 PCR扩增产物进行多重 LDR(Multiplex LDR),最后通过测序仪电泳读取检测结果。

1.3 统计学处理 计算出正常人群中 MMP-3启动子 5A/6A等位基因的频率,然后进行 Hardy-Weinber遗传平衡定律检验,以 α=0.05作为检验水准。对不同样本间 MMP-3启动子 5A/6A基因各亚型频率和等位基因频率采用配对资料的 RxC列联表进行检验,以 α=0.05作为检验水准。

2 结 果

2.1 MMP-3启动子 5A/6A等位基因的测定标本经 PCR/多重 LDR反应及测序仪电泳后应用Genemapper进行数据分析可分出 3种基因型:MMP-3 5A/5A型(数据分析图上于 125处出现 1个波峰,5A等位基因纯合子);MMP-3 5A/6A型(数据分析图上于 125、126处出现 2个波峰,杂合子);MMP-3 6A/6A型(数据分析图上于 126处出现 1个波峰,6A等位基因纯合子)(见图1)。

图1 应用 Genemapper进行数据分析,MMP-3(5A/6A)基因的分型截图,在 MMP-3(5A/6A)基因位点存在多态性:即有 5A/5A和6A/6A纯合子;也存在 5A/6A杂合子

2.2 MMP-3启动子 5A/6A基因型频率和遗传平衡间的符合程度测定 进行 Hardy-Weinberg平衡检验结果显示对照组和病例组 MMP-3启动子 5A/6A基因型频率分布符合 Hardy-Weinberg平衡(P=0.63,P=0.26)。2.3 MMP-3启动子 5A/6A基因型和等位基因频率分布比较 对照组及 MS组MMP-3(5A/6A)基因型分布(见表1),两组比较无统计学意义(χ2=2.12,P=0.35);对照组和 MS组MMP-3(5A/6A)等位基因频率(见表2),两组比较无统计学意义(χ2=0.39,P=0.53)。

表1 对照组及 MS组 MMP-3(5A/6A)基因型比较

表2 对照组和 MS组 MMP-3(5A/6A)等位基因频率比较

3 讨 论

多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种以中枢神经系统炎性脱髓鞘为特征的自身免疫性疾病,发病机制尚不明确。其炎性反应过程显示炎症细胞是在包括黏附分子和细胞因子在内所致的炎症级联反应通过细胞聚集和渗出进入大脑组织的[2],多发性硬化患者中枢神经系统病变的炎症机制使人们认识到对破坏组织的蛋白酶和调节因子应进行更多的研究[3]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases MMPs)是一类 Zn2+依赖的中性蛋白酶,与分离整和素金属蛋白酶(ADAMs)、分离整和素金属蛋白酶血栓收缩蛋白(ADATMs)共同组成金属蛋白酶(MPs)超家族。基质金属蛋白酶(MMPs)对破坏血脑屏障、炎症反应细胞进入中枢神经系统均起到重要的作用,在体外实验中还发现能降解髓磷脂和髓鞘碱性蛋白[4]。基质金属蛋白酶-3(MMP-3)能降解包括纤维结合蛋白、层粘连蛋白及 IV型胶原蛋白在内的多种细胞外基质成分,而这些成分被认为是血脑屏障(BBB)基本结构和功能成分[5]。MMP-3基因位于11q22,在 Ye S等[1]的研究中已经证实人 MMP-3启动子区域 5A/6A基因普遍存在多态性。多态性会使 MMP-3基因的转录活性发生改变,从而影响体内MMP-3水平。在 Ye S等[6]人的研究中显示体外培养的细胞中含 MMP-35A等位基因有着更强的启动子转录活性。在 Medley等[7]人的研究中发现在大动脉血管疾病中 MMP-35A/5A基因型的患者在血管壁中 MMP-3的表达和 mRNA的转录水平与杂合子基因型(5A/6A)相比是增高的,而基因型为 6A/6A的 MMP-3的表达和 mRNA的转录水平与之比较则是降低的。Maeda等[8]的研究中发现在多发性硬化患者的病灶中 MMP-3的表达水平增高,在 Kouwenhoven等[9]的研究中应用原位杂交技术检测多发性硬化患者外周血单核细胞发现 MMP-3的 mRNA转录水平增高。在 Kanesaka等[10]的研究中发现复发-缓解型多发性硬化患者中,血清 MMP-3水平显示有连续性的变化,在复发期较缓解期有明显的增高,且多在 1m内恢复至缓解期的水平。而且在 Tamara等[11]人的研究中发现 MMP-3(5A/6A)基因多态性与多发性硬化疾病严重程度相关。这些研究提示 MMP-3在多发性硬化疾病中起着重要的作用,降低 MMP-3水平或调节 MMP-3基因转录活性也许会对缓解多发性硬化患者的病情起到有益的作用。

在我们的研究中未发现 MS患者 MMP-3(5A/6A)基因各基因型和等位基因频率与正常对照组有显著性差异(P均大于 0.05),提示 MMP-3(5A/6A)基因多态性与 MS的易感性不相关。这与 Tamara等[11]人所研究的结果类似。但在进行更深一步的研究之前,我们仍不能忽略 MMP-3(5A/6A)基因遗传多态性与多发性硬化易感性之间的联系。在我们看来 MMP-3(5A/6A)基因的遗传多态性可能与多发性硬化的发病无关,其原因可能是 MS是一种多基因遗传病,MS的遗传易感性可能是由多种基因决定的,其发病依赖于多个基因独立的或累积的效应;不同人群的患者其易感基因也可能是不同的。环境因素在 MS的发病中也有着不可忽略的作用。另外,本研究所涉及的病例较少以及病例-对照研究产生的偏移也会影响研究结果。

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