一种新的呫诺美林衍生物促进小鼠神经元生成

张晓亮, 董素珍

(华东师范大学脑功能基因组学教育部、上海市重点实验室,上海 200062)

＊研究快讯＊

一种新的呫诺美林衍生物促进小鼠神经元生成

张晓亮, 董素珍

(华东师范大学脑功能基因组学教育部、上海市重点实验室,上海 200062)

0 引 言

毒蕈碱乙酰胆碱受体(M受体)是动物体内重要的神经递质受体,在中枢神经系统主要表达M 1受体.M 1受体与动物的认知功能及阿尔茨海默病(AD)的神经退行性病理过程密切相关.研究表明,许多M 1受体激动剂能通过激活M 1受体,缓解AD病理症状,并改善AD病人的认知能力,因此可以作为潜在的AD治疗药物[1].呫诺美林(Xanomelin)能特异地激活M 1受体,且二期临床实验也证明,它具有显著的AD治疗效果.但是,由于引起明显的外周神经系统副作用,它并不能成为真正的AD治疗药物[2].前期研究发现,对老年小鼠腹腔注射呫诺美林的一种新的衍生物3-[3-(3-(3-flo rophenyl)-2-p ropyn-1-ylthio)-1,2,5-thiadiazol-4-yl]-1,2,5,6-tetrahydro-1-methylpyridine Oxalate(EU K1001),能显著改善其认知能力,增强其海马突触可塑性,效果比呫诺美林更显著.值得注意的是,EUK1001引起的动物毒副作用更小.这些结果表明,EUK1001有望成为一种新的AD治疗药物[3].但 EU K1001改善小鼠学习与记忆能力的机理,目前还不清楚.

已有研究表明,成年哺乳动物脑内持续有新的神经元生成,新的神经元出现的脑区主要集中在海马齿状回(dentate gyrus,DG)的颗粒下层(subgranular zone,SGZ)和脑室管膜下区(subventricular zone,SVZ),并且海马齿状回的神经生成在动物的学习与记忆过程中起重要作用[4].另有研究显示,调控前脑的乙酰胆碱水平直接影响成年动物的神经生成及学习记忆能力[5].因此,我们推测,EUK1001也能调控成年动物的神经生成,这可能是它改善小鼠记忆能力的基础.为了验证这一猜想,我们检测了 EUK1001处理小鼠后脑内神经生成的情况.

1 材料和方法

1.1 实验动物分组及处理

EU K1001由北京大学药学院雷小平教授的实验室合成并提供.将18只7～8周龄的C57BL/6小鼠随机分成两组,即EU K1001组和对照组.对EUK1001组每天进行1 mg/kg的EUK1001腹腔注射,对照组给予等量生理盐水腹腔注射,各持续15 d.为了检测小鼠的神经生成情况,在给予EUK1001或生理盐水的最后两天,两组小鼠均给予BrdU腹腔注射(100 mg/kg),每天4次,每2 h一次.

1.2 组织固定、取材及切片

在最后一次注射后16 h,麻醉小鼠,暴露心脏,用灭菌生理盐水灌注5 min,4℃4%多聚甲醛固定30 min.随后分离出整个脑组织,投入4%多聚甲醛中,于4℃后固定2 h,然后依次经过20%和30%蔗糖溶液脱水至脑组织沉底.将处理好的脑组织在Leica1850切片机上进行冰冻切片,厚度为30μm;切片-20℃保存.

1.3 免疫组化

对来自EUK1001组或对照组小鼠的脑片进行免疫组化,详细过程参考[6].切片平衡到室温,1×PBS洗5 min×3次,在95～98℃0.01 mol/L的柠檬酸缓冲液中抗原修复15 min,然后冷却20 min.1×PBS洗5 min×3次后,加5%山羊血清封闭2 h,加小鼠源的anti-BrdU抗体(M illipore,1∶5 000)和兔anti-Double Co rtin(DCX)抗体(Abcam,1∶200)4℃孵育过夜.1×PBS 5 min×6次漂洗后,加cy3标记的抗小鼠二抗(M illipore,1∶500)和A lexa-488标记的抗兔二抗(Invitrogen,1∶1 000)室温孵育2 h,1×PBS充分冲洗.DAPI复染5 min,用防淬灭荧光封片剂封片.用Nikon荧光显微镜观察并拍照.计数各小鼠脑片DG中BrdU阳性细胞数,并进行统计分析.

2 结 果

图1(A-F)为代表性的EU K1001组和对照组的免疫组化结果.在EU K1001处理的动物组,每个海马的平均BrdU阳性细胞数为1 563.4±122.1;而对照组每个海马的平均BrdU阳性细胞数为1 012.2±63.9.与对照组相比,EU K1001组的海马SGZ及整个DG的新生神经细胞数目明显增加 (见图1G,P<0.01),而SVZ的新生神经细胞数目则没有明显差异 (见图2).表明 EU K1001处理能促进成年小鼠海马DG的神经生成,但对SVZ神经生成则没有明显效果.从图3可以看出,大部分BrdU阳性细胞表达不成熟神经元标记DCX,因此EU K1001处理能促进DG的神经元生成.

图1 EU K1001促进海马SGZ的神经生成Fig.1 EU K1001 treatment enhanced hippocampal neurogenesis in mice

图2 EU K1001处理没有明显影响SVZ的神经生成Fig.2 EU K1001 treatment had no significant effectson the neurogenesisof SVZ

图3 BrdU标记细胞大部分为DCX阳性标记细胞,即新生神经元Fig.3 Most of the BrdU+cells(red)are labeled w ith DCX(green)

3 讨 论

研究表明,乙酰胆碱系统参与调控成年动物海马的神经生成[5].损伤前脑胆碱能神经元导致DG神经元生成减少,并且伴随着动物空间记忆缺陷[7];而胆碱能激动剂physostigmine促进DG神经元生成,对SVZ神经生成情况则没有影响[5].前脑乙酰胆碱水平影响新生神经细胞数目及新生细胞的短期生存,但对长期生存没有影响[5].同时新生的神经细胞表达M 1受体[5].乙酰胆碱酯酶抑制剂处理增加新生神经元的存活,但不影响神经前体细胞的增殖[8].因此,提升脑内乙酰胆碱水平或激活M受体能促进新生神经元生成或存活.

结果显示,15 d的EU K1001腹腔注射能显著增加年轻成年小鼠的海马区的神经生成,但不影响SVZ神经生成.EUK1001对SGZ及SVZ神经生成的影响不一致,可能与成年动物SGZ与SVZ神经生成存在不同的调节机制[9]有关,具体原因有待深入研究.EUK1001是M 1受体的激动剂[3],因此小鼠海马区神经元生成的促进可能是由于M 1受体被激活引起的.

EU K1001能改善老年小鼠的认知功能缺陷,提高海马突触可塑性,相对于M 1受体激动剂呫诺美林有更低的毒性,是潜在的AD治疗药物.本实验又证实它能促进成年小鼠海马神经生成,这可能是它改善小鼠学习记忆能力的原因.但是进一步的分子机制还有待深入研究.

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Increased neurogenesis in adultm ice by a novel derivative of xanomeline

ZHANG Xiao-liang, DONG Su-zhen

(Key Lab of B rain Functional Genom ics,MOE&STCSM,East China Normal University,Shanghai 200062,China)

Q189

A

1000-5641(2010)04-0137-04

2010-03

张晓亮,男,硕士研究生.E-mail:zxliang1982@126.com.

董素珍,女,助理研究员.E-mail:szdong@brain.ecnu.edu.cn.