巢氏PCR判定西藏疟疾流行区传疟媒介*

武 松,黄 芳,张国庆,潘嘉云,王学忠,卓玛央金,胡永红,汤林华

2.中国疾病控制中心寄生虫病预防控制所,世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心,上海 200025;

3.云南省寄生虫病研究所,普洱 665000;

4.西藏自治区林芝地区疾病预防控制中心,林芝860100

巢氏PCR判定西藏疟疾流行区传疟媒介*

武 松1,黄 芳2,张国庆2,潘嘉云2,王学忠3,卓玛央金4,胡永红4,汤林华2

目的确定西藏墨脱县疟疾流行区的疟疾传播媒介。方法根据2005、2006和2007年疟疾发病情况,在墨脱县选择了3个疟疾发病较高的自然村,采用人诱、牛诱、灯诱及清晨人房全捕等方法捕获成蚊,经形态学鉴定后麻醉处死,密封干燥,带回实验室-20℃冻存备用,采用混合样本法随机抽取10只多斑按蚊复合体为一份混合标本,提取蚊虫DNA。根据文献采用巢氏PCR扩增疟原虫小亚单位核糖体脱氧核糖核酸(SSU rDNA),并对阳性结果克隆测序,比对证实。结果共捕获按蚊5 345只,其中多斑按蚊复合体5 190只,带足按蚊155只,提取的360份多斑按蚊复合体混合样本DNA中发现子孢子阳性扩增样品2份,种型鉴定2份阳性混合样本均为伪威氏按蚊,PCR产物经克隆测序,NCBI BLAST同源性比对证实为疟原虫SSu rDNA基因片段。结论多斑按蚊复合体中的伪威氏按蚊为西藏林芝疟疾流行区的传疟媒介。

多斑按蚊复合体;子孢子;传疟媒介;西藏;巢氏聚合酶链反应

2.中国疾病控制中心寄生虫病预防控制所,世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心,上海 200025;

3.云南省寄生虫病研究所,普洱 665000;

4.西藏自治区林芝地区疾病预防控制中心,林芝860100

西藏自治区于20世纪50年代就偶有疟疾报道,主要分布于东南部雅鲁藏布江和察隅河河谷地带的墨脱和察隅等县,以及喜马拉雅山南麓海拔1 500m以下的地区。林芝地区是西藏自治区唯一有疟疾发生与流行的地区〔1〕,其中的墨脱县地处雅鲁藏布江峡谷亚热带湿润气候区,自1986—2004年累计报告疟疾病例2 441例,占林芝地区报告病例数的99.3%〔2〕,2005年和2006年疟疾发病率分别为568.48/10万和694.08/10万,发病人数分别占林芝地区疟疾总发病率的 59.14%(59/93)和95.17%(67/70),近年来该地区的疟疾发病呈逐渐增多并存在向周边蔓延的趋势,然而该地区传疟媒介至今依旧不清,严重影响着对该地区的疟疾流行形势评价和疟疾综合防制措施的制定,调查组于2007年7至8月在西藏林芝地区墨脱县开展了疟疾媒介专项调查,并运用PCR的方法对现场捕获的多斑按蚊复合体进行子孢子阳性检测。

1 材料与方法

1.1 调查点与调查时间 根据历年与当年疟疾发病情况,在墨脱县选择了疟疾发病相对较高的德兴乡德兴村(29°33′N,95°30′E),墨脱镇亚东村(29°32′N,95°33′E)和马迪村(29°37′N,95°41′E)开展了传疟媒介的蚊种调查。

1.2 成蚊捕获与形态鉴定 采用人帐诱捕法、牛饵诱捕法和诱蚊灯诱捕法,在室内、室外及人房、牛房捕获成蚊;同时采用清晨人牛房全捕、半通宵和全通宵诱捕等方法。对捕获的蚊种经形态学鉴定为多斑按蚊复合体后麻醉处死,每10只装入打孔的1.5mL离心管,放入装有干燥剂的自封袋,带回实验室后-20℃冻存备用,形态学鉴定方法参考陆宝麟〔3〕。

1.3 分子实验方法

1.3.1 基因组DNA提取 根据李凤舞和孙庆文〔4-5〕混合样本的理论,单只蚊虫去除腹部、翅膀和腿部,仅留头胸部,将10只蚊虫的头胸部混合作为一个混合样本。混合样本放入1.5 mL离心管,加入 150 μ L 65 ℃DEB 溶液和 2.0 μ L RNAse酶(10 μ g/μ L),充分研磨后,放入37℃水浴1h,再加入4.0 μ L 蛋白酶 K(20μ g/μ L),50℃水浴 1h,每管加入苯酚和氯仿各60μ L,充分振荡混匀,14 000r/min离心10min,取上清于0.5mL离心管中,加入95%冰乙醇300μ L,-20℃沉淀过夜后,14 000r/min离心10min,弃上清,37℃恒温箱中干燥后,加入 100μ L 1×TE缓冲液,-20℃保存备用。

1.3.2 巢氏PCR扩增子孢子 蚊体内子孢子检测方法采用Snounou〔6〕方案,第一轮 PCR为属特异扩增,引物分别为rPLU5(5'-CCTGTTGTTGCCTTAAACT TC-3')和rPLU6(5'-T TAAAATTGTTGCAGT TAAAACG-3'),第二轮PCR反应的引物为针对SSUrRNA设计的种特异性引物,分别为rVIV1(5'-CGCTTCTAGC T TAATCCACATAACTGATAC-3')和rVIV2(5'-ACTTCCAAGCCGAAGCAAAG A AA GTCCT TA-3')。反应体系为 50 μ L,参照 Tassanakajon〔7〕,取首轮反应产物1μ L作为第二轮反应的模板。两轮反应的条件均为 95℃5min,55℃ 90',72℃ 90',94℃1min,最后一个循环结束后72℃温育10min。

1.3.3 多斑按蚊复合体种型鉴定 多斑按蚊复合体种型鉴定采用马雅军〔8〕建立的多重PCR的方法,根据扩增出的ITS2片段的大小就行多斑按蚊种型鉴定。

1.4 试剂与材料 引物、redTaq酶及dNTPs由上海塞百盛公司合成与购买,RNA酶和蛋白酶K购自北京鼎国生物公司,PCR仪为BIO-RAD PTC-200型,凝胶成像系统(AlphaImager HP/EP)为美国Alpha Innotech公司,PCR产物测序由上海生工生物工程技术有限公司完成,CDC诱蚊灯由美国John W.Hock公司生产(New Standard Miniature Light Traps 512 6V 150mm)。

2 结 果

2.1 形态学鉴定本次调查共捕获成蚊10 247只,按蚊为5 345只,其中5 190只为多斑按蚊复合体,占按蚊组成97.10%;带足按蚊155只,占按蚊组成的2.90%。形态学鉴定未能发现其他种类按蚊。

2.2 子孢子阳性检测 本次实验共提取3 600只多斑按蚊复合体,计混合样本360份,其中有两个混合样本扩增出121bp的目标条带(见图1)。对2个目标条带进行克隆测序,片段序列为5'-ACT TCCAAGCCGAAGCAAAGAAAGTCCT TAAAAAGAATCATT TTAAT TAAAAGAACACATAAT AGCAAAATGCGCACAAAGTCGATACGAAGTATCAGT TATGTGGAT TAAGCTAGAAGCG-3',通过序列比对发现与间日疟序列AF145335的nt 520～640的序列完全吻合,从而可以判定扩增出的确实为间日疟的SSUrDNA的基因序列,因此可以判定混合蚊虫的样本中含有疟原虫。

图1 巢氏PCR子孢子检测结果Fig.1 Nested PCR results on sporozoites detection

2.3 种型鉴定 对检测出121bp目标片段的2份混合标本,进行种型鉴定实验,结果2份混合标本均只扩增出伪威氏按蚊的目标条带,结果见图2。因此可以认为2份混合样本共20只多斑按蚊复合体其实仅包含伪威氏按蚊。

3 讨 论

西藏林芝地区墨脱县地理环境特殊,东临察隅县,南与印度萨蒂亚相连,西与米林、林芝县相邻,北与波密县接壤,是全国唯一尚未通公路的县。自1976年起该县已有疟疾发病报告,近年疟疾发病呈现逐渐增多的趋势,但由于交通不便,通讯不畅以及缺乏专业疟防人员,至今该地的传疟媒介尚未确定。

图2 子孢子阳性的混合样本种型鉴定结果Fig.2 Result of species identification of pool samples with sporozoites positive

疟疾流行区的传疟媒介判定工作是进行疟疾防治最为根本的基础,也是制定疟疾综合防治措施的前提。子孢子阳性检测是传疟媒介最为直接和有效的方法〔9〕,传统的检测方法是人工解剖按蚊唾液腺发现子孢子,解剖人员需要经过专业的培训,并且耗时,费力。由于一般按蚊的子孢子自然感染率约为1～3‰左右〔10-11〕,所以若用唾液腺解剖方法来鉴定传疟媒介将耗费大量的人力和时间。

近年来,ELISA〔11-12〕和 PCR〔13-14〕方法已广泛运用于按蚊唾液腺内的子孢子检测。ELISA主要是检测疟原虫子孢子的环子孢子蛋白(CSP),而PCR主要是用于扩增子孢子基因组的一段特定的序列。两种方法相比,PCR方法检测子孢子的灵敏度和特异度均高于ELISA的方法〔15〕。普通PCR可以扩增出仅10个子孢子〔16〕,而巢氏PCR能够出仅含3个子孢子的蚊虫DNA样本〔4〕,可以用于少量的现场标本检测,本研究采用混合样本的方法〔4-5〕将PCR方法拓展到现场大量标本的子孢子检测研究。

伪威氏按蚊为泰国与缅甸边境地区的传疟媒介〔17-18〕,本次研究现场为中国与缅甸边境地区。董学书〔19〕也曾研究发现伪威氏按蚊的季节增长与疟疾的流行趋势相一致。陆宝麟〔3〕曾报道威氏按蚊偏吸畜血,对疟原虫不明感,在疟疾流行病学上意义不大;而伪威氏按蚊嗜吸人血,人血指数可达42.85%,对疟原虫非常敏感,与我国云南西双版纳地区的疟疾流行关系密切。

子孢子rDNA是真核细胞较为保守的结构基因,不同种属的疟原虫SSUrRNA编码基因的序列比较发现,属内保守区和种间高度可变区间隔排列。疟原虫rDNA基因为多拷贝基因,SSUrRNA在细胞中的含量极为丰富,故该基因被认为是疟原虫基因检测和种间鉴别理想靶基因。本研究采用混合样本和巢氏PCR扩增子孢子SSUrRNA,在360份混合样本(3 600只按蚊)中检测出2份标本含有疟原虫的子孢子,并对2份样本进行种型鉴定发现其均为伪威氏按蚊,从而最终判定伪威氏按蚊为西藏疟疾流行区的疟疾传播媒介。同时参照PCR子孢子检测结果,伪威氏按蚊的子孢子自然感染率约为0.56‰(2/3600),虽然较低,但由于其数量巨大,种群密度高,依旧可以成为该地区的主要传疟媒介。

〔1〕胡永红,胡松林,李成才.1986-2004年西藏林芝地区疟疾疫情分析〔J〕.中国血吸虫病防治杂志,2006,18(2):124.

〔2〕洛桑,胡永红,胡松林,等.西藏林芝地区1986-2004疟疾流行特性分析〔J〕.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2005,23(6):457-459.

〔3〕陆宝麟,等.中国动物志昆虫纲第九卷双翅目蚊科(下卷)〔M〕.北京:科学出版社,1997:88,92,99,102,106.

〔4〕LI FW,Niu C,Ye BH.Nested polymerase chain reaction in detection ofPlasmodium vivaxsporozoites in mosquitoes〔J〕.Chinese Medical Journal,2001,114(6):654-657.

〔5〕孙庆文,朱淮民,陆柳,等.混合样本方法检测蚊虫子孢子阳性率数学模型的再研究〔J〕.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2002,20(6):351-353.

〔6〕Snounou G,Pinheiro L,Goncalves A,et al.The importance of sensitive detection of malaria parasites in the human and insect hosts in epidemiological studies,as shown by the analysis of field samples from Guinea Bissau〔J〕.T rans R Soc T rop Med Hyg,1993,87(6):649-653.

〔7〕Tassanakajon A,Boonsaeng V,Wilairat P,et al.Polymerase chain reaction detection ofPlasmodium falciparumin mosquitoes〔J〕.T rans R Soc T rop Med Hyg,1993,87(3):273-275.

〔8〕 M aYJ,LI SZ,Xu JN.Molecularidentification an dphylogeny of the Maculatus group of Anopheles mosquitoes(Diptera:Culicidae)based on nuclear and mitochondrial DNA sequences〔J〕.Acta T ropic,2006,99:272-280.

〔9〕卫生部疾病预防控制局.疟疾防治手册〔M〕.3版.北京:人民卫生出版社,2007.77-78.

〔10〕郭传坤,李锦辉,覃业新.广西疟疾媒介的地理分布、生态习性和传疟作用〔J〕.中国媒介生物学及控制杂志,2007,189(2):112-115.

〔11〕周红宁,张再兴,Chris Curtis,等.ELISA检测云南按蚊环子孢子蛋白的评价〔J〕.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2004,22(4):227-230.

〔12〕Cuamba N,Choi KS,Townson H.M alaria vectors in Angola:Distribution of species and molecular forms of theAnopheles gambiaecomplex,their py rethroid insecticide knockdown resistance(kdr)status andPlasmodium f alciparumsporozoite rates〔J〕.Malar J,2006,5:2.

〔13〕Stoffels JA,Leeuwen WM,Post RJ.Detection of plasmodium sporozoites in mosquitoes by polymerase chain reaction and oligonucleotide rDNA probe,without dissection of the salivary glands〔J〕.M ed Vet Entomol,1995,9(4):433-437.

〔14〕M oreno M,Cano J,Nzambo S,et al.Malaria panel assay versus PCR:Detection of naturally infectedAnopheles melasin a coastal village of Equatorial Guinea〔J〕.Malar J,2004,3:20.

〔15〕Vythilingam I,Nitiavathy K,Yi P,et al.A highly sensitive,nested polymerase chain reaction based method using simple DNA extraction to detect malaria sporozoites in mosquitos〔 J〕.Southeast Asian J T rop Med Public Health,1999,30(4):631-635.

〔16〕Tassanakajon A,Boonsaeng V,Wilairat P,et al.Polymerase chain reaction detection ofPlasmodium f alciparumin mosquitoes〔J〕.T rans R Soc T rop Med Hyg,1993,87(3:273-275.

〔17〕Green CA,Rattanarithikul R,Pongparit S,et al.A newly-recognized vector of human malarial parasites in the oriental region,Anopheles(cellia)pseudowillmori(theobald,1910)〔J〕.T rans R Soc T rop M ed Hyg,1991,85(1):35-36.

〔18〕Green CA,Rattanarithikul R,Charoensub A.Population genetic confirmation of species status of the malaria vectorsAnopheles willmoriandAnopheles pseudowillmoriin Thailand and chromosome phy logeny of the maculatus g roup of mosquitoes〔J〕.Med Vet Entomol,1992,6(4):335-341.

〔19〕董学书,周红宁,宁毕艳,等.云南多斑按蚊种团的地理分布、生态习性与疟疾的关系〔J〕.寄生虫与医学昆虫学报,1996,3(2):100-105.

Nested PCR identified the malaria vector in Tibet malaria endemic area

WU Song,H UANG Fang,ZHANG Guo-qing,PAN Jia-yun,WANG Xue-zhong,ZUOMA Yang-jin,HONG Yong-Hong,TANG Lin-hua
(Schoolof Integrated Traditional and Western Medicine of Anhui College of Chinese Traditional Medicine,Hefei230038,China)

To find the malaria vectorsin malaria-epidemic area in Linzhi district,Tibet,three villages with higher malaria incidence were selected as investigation spots.Human-baited traps,cow-baited traps,CDC light traps and morning collection were adopted to collect mosquitoes.M osquitoes were killed after identified asAnopheles maculatuscomplex and stored with desiccant at-20℃.DNA was extracted from mixed mosquito sample.SSU rDNA of sporozoites was amplified according to reference,and the positive products of PCR were cloned,sequenced and blasted for confirmation.Of 5 190 out of 5 345Anophelesmosquitoes wereAnopheles maculatuscomplex and the remainders wereAnopheles peditaeniatus.Two positive samples were foundin 360 mixedAnophelesmaculatuscomplex DNA samples,andidentified asAnopheles pseudowillmoriby species identification method.It＇s indicated thatAnopheles pseudowillmoriofAnopheles maculatuscomplex is the malaria vector in Linzhi malaria-endemic area.

Motuo;Anopheles maculatus complex;sporozoites;Malaria vector;Tibet;nested PCR

R531.3

A

1002-2694(2010)07-0648-03

*卫生行业科研专项项目(200802021)、第五轮中国金全球基金疾病项目实验施情研究(GF/M 5/2010-04)和安徽省优秀青年教师基金(2009SQ RZ119)联合资助

汤林华,Email:ipdtlh@public3.net.cn

1.安徽中医学院中西医结合临床学院,合肥 230038;

2010-01-04;

2010-03-03