MYCT-1基因真核表达载体的构建及鉴定

梅 旭,刘 政,邱广斌

(解放军202医院 检验科,辽宁 沈阳 110003)

MYCT-1基因真核表达载体的构建及鉴定

梅 旭,刘 政,邱广斌*

(解放军202医院 检验科,辽宁 沈阳 110003)

目的 构建MYCT-1(myc target)基因真核表达载体,观察其转染胃粘膜GES-1细胞系后的表达。方法用RT-PCR法合成MYCT-1 cDNA,克隆至表达载体pcDNA3.1上,测序验证无突变发生。将表达载体转染GES-1细胞,用RT-PCR和Western blot检测MYCT-1基因的表达。结果限制性内切酶酶切和DNA测序证实成功克隆了MYCT-1 cDNA全长并正确插入了表达载体,在GES-1细胞中检测到MYCT-1mRNA和蛋白。结论成功构建了MYCT-1真核表达载体,可在GES-1细胞中稳定表达。

MYCT-1;表达载体;转染

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1161)

MYCT-1(myc target)基因是我室克隆的一个新基因,曾命名MTLC(myc target from laryngeal carcinoma cells)[1]。研究表明MYCT-1在多种肿瘤组织中表达降低,可能是一个新的抑癌基因[2-5]。为了进一步探讨MYCT-1的基因功能及在肿瘤发生中的可能机制,在本研究中,我们构建了MYCT-1基因的真核表达载体,并将其转染粘膜GES-1细胞系,以鉴定重组载体表达的稳定性。

1 材料与方法

1.1 材料TRIZOL试剂、RPMI1640培养基(Gibco-BRL公司),反转录酶、Taq酶(Promega公司),Lipofectamin2000脂质体转染试剂盒、pcDNA3.1载体、G418(Invitrogen公司);JM 109菌株、BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶(TaKaRa公司);人胃粘膜细胞系GES-1细胞购自北京肿瘤研究所。抗MYCT-1单克隆抗体由本室自制。

1.2 RT-PCRTRIZOL试剂提取正常胃组织总RNA,用反转录酶合成cDNA第一链,PCR扩增MYCT-1 cDNA。所用引物序列:正向引物:5′-ATGGATCCCTGCACTGGCTGA TGAGTGTGTA-3′;反向 引物 :5′-GTAAGCTTGAACAGTGCCTTCACCCTCGA GGT-3′。反应条件:95℃预变性1 min,然后以95℃30 s、60℃1min、72℃1.5min进行30个循环,最后72℃延伸10min。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

1.3 载体构建PCR扩增得到的MYCT-1 cDNA片段经TA克隆连接到pMD18-T载体上。用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切重组质粒,回收目的片段,克隆到pcDNA 3.1载体上,测序证实无突变发生。

1.4 细胞转染接种1.5×105GES-1细胞至35mm培养皿中,以含10%FBS的RPMI1640培养过夜。用Lipofectamin2000将表达载体 pcDNA3.1-MYCT-1及对照质粒pcDNA3.1分别转染BGC823细胞,继续培养24 h后加入G418至终浓度5 mg/m l,CO2孵箱孵育过夜。更换培养基后继续培养24 h,胰酶消化,转入96孔板继续培养。

1.5 RT-PCR检测GES-1细胞MYCT-1 mRNA表达TRIZOL试剂提取GES-1细胞总RNA,RT-PCR检测 MYCT-1 mRNA,正向引物 :5′-GAGTCCATGGCCAGAAAACT-3′;下 游 引 物 :5′-ATGCCTTGATGATGGACTCA-3′,扩增产物长度为504bp,方法同上。

1.6 Western blot检测GES-1细胞MYCT-1蛋白表达收集1.5×105待检测的细胞,加入RIPA裂解液,冰上静置5 min,4℃、12 000 rpm离心30 min,收集上清,电泳、转膜、封闭,加鼠抗人MYCT-1抗体(1∶1 000),4℃杂交过夜,加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1∶5 000),杂交2h,将膜浸入ECL工作液中2min,随后进行压片检测,显影定影,获取图像。

2 结果

2.1 RT-PCR结果PCR产物琼脂糖电泳结果为单一条带,大小约1 000 bp,与预期相符(图1)。

图1 PCR扩增产物电泳结果

图2 qcDNA3.1-MYCT-1 BamHⅠ/EcoRⅠ酶切产物电泳结果

2.2 重组载体BamH Ⅰ/EcoRⅠ酶切鉴定结果pcDNA3.1-MYCT-1经BamH Ⅰ/EcoRⅠ消化得760 bp和4 900 bp两个片段,酶切产物电泳结果与预期相符(图2)。

2.3 MYCT-1 mRNA在GES-1细胞中的表达与未转染细胞和转染空质粒对照细胞相比,转染pcDNA 3.1-MYCT-1载体的细胞MYCT-1mRNA表达明显增加(图3)。

2.4 Western blot结果与未转染细胞和转染空质粒对照细胞相比,转染pcDNA3.1-MYCT-1载体的细胞MYCT-1蛋白表达明显增加(图4)。

图3 GES-1细胞MYCT-1 mRNA检测结果

图4 W estern b lot结果

3 讨论

MYCT-1是我室克隆的一个新基因,为原癌基因c-Myc的一个靶基因。c-Myc是一个含亮氨酸拉链的转录因子,通过大量靶基因如CAD、ODC 、LDH-A、cyclin E 、M rDb 、telomerase/hTERT 、rcl 、IRP2 、cdc25A 、JPO1可广泛参与细胞转化、细胞分化、凋亡及细胞周期调控[6-7]。研究表明MYCT-1在多种肿瘤组织中表达降低,可能是一个新的抑癌基因。

在前期研究中,我们证实MYCT-1mRNA、蛋白在胃癌组织中表达下调,且在癌旁组织、癌组织及转移淋巴结组织中依次降低,可能与胃癌的发生、发展及转移有关。我们利用 RNA干涉技术将胃粘膜GES-1细胞中MYCT-1基因沉默,发现MYCT-1表达降低虽然不能直接导致正常胃粘膜细胞恶性转化,但引起胃癌细胞增殖减慢,凋亡增加,细胞周期S期延长,提示MYCT-1基因的功能可能是抑制细胞DNA合成。

为了进一步探讨MYCT-1的基因功能及在胃癌发生发展过程中的作用机制,在本研究中,我们构建了MYCT-1基因的真核表达载体,并将其成功导入GES-1细胞。结果表明GES-1细胞中检测到MYCT-1mRNA和蛋白,证实重组载体pcDNA3.1-MYCT-1能够在GES-1细胞中稳定表达。我们将通过研究MYCT-1在GES-1细胞中过表达对细胞的形态、生长特性、细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡等方面的影响,进一步阐明MYCT-1基因在胃癌发生过程中可能的功能及信号传导通路。

[1]邱广斌,贺 光,孙开来,等.6q25区域一个新基因MYCT-1的克隆及特性分析[J].中华医学遗传学杂志,2003,20:94.

[2]Qiu GB,Gong LG,Hao DM,etal.ExpressofMTLC gene in gastric carcinoma[J].World Journalof Gastroenterology,2003,9:2160.

[3]欧阳小明,黄世章,梅开勇.MTLC基因在乳腺癌组织中的表达及其意义[J].中国煤炭工业医学杂志,2006,7:21.

[4]刘水平,贺剑鸣.MTLC基因在肝细胞癌及其癌旁肝组织中的表达[J].湘南学院学报(医学版),2006,8:16.

[5]邱广斌,郝冬梅,宫立国,等.MTLC基因在喉癌组织中的低表达及其对喉癌Hep2细胞凋亡的影响[J].中华检验医学杂志,2005,28:1178.

[6]林 源,刘绍平,罗汉传,等.VEGF,p53,p21(WAF/CIP1)和 C-myc蛋白表达与肝细胞癌预后关系的研究[J].中国普通外科杂志,2009,18:874.

[7]艾金霞.SBHL对HeLa细胞c-myc,H-ras和hTRT基因表达的研究[J].北华大学学报(自然科学版),2009,10:319.

Construction and identification of an eukariotic expression vector ofMYCT-1

MEIXu,LIU Zheng,QIU Guang-bin.(Departmentof LaboratoryMedicine,No.202Hospital of PLA,Shenyang110003,china)

ObjectiveTo constructan eukariotic expression vectorofMYCT-1 and detectits expression after transfected in GES-1 cells.MethodsMYCT-1 cDNAwas synthetized by RT-PCR and then cloned into an expression vector pcDNA3.1.DNA sequencing was performed to avoid anymutation in recombianant vector.The vector pcDNA3.1-MYCT-1 was transfected intoGES cells by liposome and the expression ofMYCT-1was detected by RT-PCR and Western blot.ResultsThe full length cDNA ofMYCT-1 cloned into the exoression vectorwas identified by restricted enzyme digestion and sequencing.MYCT-1mRNAs and p roteinwere detected in GES-1 cells.ConclusionAn eukariotic efxpression vector of MYCT-1 was ssuccessfully constructed.The reconbinant vector could expressed in GES-1 cells steadily.

MYCT-1;expression vector;transfection

Q784

A

1007-4287(2010)08-1161-02

辽宁省自然科学基金项目(20092084)

*通讯作者

2009-12-23)