急性大鼠脊髓损伤Allen's法模型的改良及电生理评价

李一帆,陈 东,张大威,薛 辉,刘佳梅

(1.吉林大学白求恩医学院组织学与胚胎学教研室,吉林长春 130021;2.长春中医药大学基础医学院解剖教研室;3.广东医学院组织学与胚胎学教研室;4.吉林大学白求恩医学院机能科学实验平台)

急性大鼠脊髓损伤Allen's法模型的改良及电生理评价

李一帆1,2,陈 东1,3*,张大威4,薛 辉1,刘佳梅1

(1.吉林大学白求恩医学院组织学与胚胎学教研室,吉林长春 130021;2.长春中医药大学基础医学院解剖教研室;3.广东医学院组织学与胚胎学教研室;4.吉林大学白求恩医学院机能科学实验平台)

目的 建立一种更实用、标准、可靠的急性大鼠脊髓撞击损伤模型,为脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的进一步研究奠定基础。方法将36只成年雌性Wistar大鼠随机分成三组,每组12只。脊髓损伤(SCI)组:用自制改良的Allen's撞击器,以60gcm致伤力损伤大鼠T10胸椎对应脊髓。假手术组:只打开椎板,暴露脊髓,不造成SCI。正常对照组:正常大鼠,不做任何处理。各组定期行为学观察(BBB评分),术后30天进行组织学观察和神经电生理检测。结果HE染色:假手术组与正常对照组基本一致的。SCI组可见灰、白质组织结构不完整,损伤区可见大片坏死灶、细胞肿胀。BBB评分:假手术组术后1周功能恢复接近正常。SCI组术后第2周开始恢复,到第3周基本停止,最终BBB评分未超过6分,两组比较有明显差异。神经电生理(SEP,MEP)检测:SCI组可以明显看到SEP与MEP的峰-峰值急剧降低,且潜伏期明显延长,差异显著(P＜0.01)。结论改良后的急性大鼠脊髓损伤模型制作法操作简便、重复性好,是较为理想的方法。

动物模型;脊髓损伤;BBB评分;电生理;改良

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1169)

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是交通、工矿事故及运动意外中常见的中枢神经系统损伤性疾病,损伤所致的截瘫严重影响伤者的身心健康,目前,脊髓损伤模型繁多,但尚无统一的分型[1,2]。建立一个标准、理想的SCI实验模型,是进行SCI基础研究的前提。本研究在Allen's打击法的基础上进行了一些改进,以建立一种更标准化、理想化的大鼠脊髓撞击损伤模型。

1 材料与方法

1.1 材料

脊髓打击装置:自制改良的Allen's撞击器,均由不锈钢材料制成,击打棍直径4.0mm,打击头呈凸形,重量20 g,击打棍套管内直径4.1mm,套管外侧面有刻度标记,可以调整击打棍下落高度,范围为3-10 cm。

1.2 动物及分组

36只体重200～250 g雌性健康的Wistar大鼠,由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。常规饲养于安静通风环境下,室内温度20～23℃,湿度50%～65%,饲养3 d后手术。动物随机分三组,每组12只。正常对照组,不做任何处理;假手术组,只打开椎板,暴露脊髓,不造成SCI;脊髓损伤(SCI)组,按下列方法制作模型。

1.3 模型制作及术后护理

所有器械经高压蒸汽灭菌。取正常雌性Wistar大鼠,体重 200～250 g,用10%水合氯醛作腹腔麻醉(0.35 m l/100 g),将大鼠俯卧,固定于大鼠固定板上,在背部脊髓两侧触摸大鼠最下肋与软组织分界处(浮肋与第13胸椎连接处)作为骨性定位标志,向上、下5 cm范围备皮、脱毛后用碘酊、酒精常规消毒,铺无菌手术单,在后正中线做纵行切口,大约3 cm,依次切开皮肤、皮下筋膜,暴露椎旁肌,肉眼观察,可见椎旁肌表面银白色腱膜,两侧腱膜在后正中线最接近处,约平对第10胸椎棘突,用玻璃分针钝性剥离肌肉暴露棘突、椎板和横突。参考定位:T9棘突倾向尾侧,T10棘突中立位,T11棘突倾向头侧[5]。确定T10胸椎位置,用骨剪在T9与T10、T10与T11棘突及相应椎板之间分别做两个横行剪口,再在T10胸椎两侧,横突与椎板连接处做纵行剪口,形成一个方形剪口界线,然后用咬骨钳咬住T10胸椎棘突用力拉起即“揭盖”,去除T10椎板,形成方形骨窗,修整骨窗边缘,充分暴露T10对应的脊髓。用自制改良的Allen's撞击器制备脊髓损伤动物模型,打击时,用拉钩拉开脊髓两侧软组织,牵拉固定,使脊柱稳定,不受呼吸运动影响,使20 g重量的击打棍从3 cm高度自由落体,致伤能量60 g◦cm,撞击T10骨窗对应的脊髓,造成急性脊髓损伤,击打脊髓后,击打棍不动,停留3min再移开。撞击成功标准为:撞击脊髓组织水肿、出血,硬脊膜完整呈紫红色,紧张,膨隆,大鼠尾巴出现痉挛性摆动,双下肢躯体回缩样扑动,呈迟缓性瘫痪。常规分层缝合后回笼饲养。7 d内单独饲养,7 d后5只合笼饲养。自然光照,定时定量给以软饲料喂养,饮水不加限制,饲养环境温度20～23℃,湿度50%～60%。术后开始每日腹腔注射青霉素 8万U/只,庆大霉素0.2万U/只,预防术后感染,维持7 d。术后人工排尿,左手撑起小鼠腹部,右手触摸找到充盈的膀胱,然后按住膀胱底部,自上而下地轻柔挤压,逼尿排出。挤压膀胱后,及时清理会阴,使其保持干燥,并时常改变体位。如此人工排尿每日2次,直到动物自身排尿反射恢复。每2～3 d更换一次垫料。大鼠共计死亡1只,出现在SCI组术后20 d,解剖后发现死因为肠梗阻,随后补充SCI组1只入实验。

1.4 检测指标

1.4.1 组织学观察 每组饲养30 d后,各取6只大鼠,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后,将大鼠固定于固定板上,生理盐水、4%多聚甲醛常规灌流固定,暴露脊髓T8～T12,迅速取出脊髓组织,4%多聚甲醛后固定4 h,梯度蔗糖脱水,放入OCT中室温浸10 min,包埋,入冷丙酮中冷冻后,-70℃保存。用恒冷箱切片机做冠状面切片,厚16μm,行HE染色。

1.4.2 行为学观察 参照Basso等提出并改良的脊髓损伤大鼠功能恢复评判标准即 BBB评分法[6,7](共21级),双盲法对各组动物后肢运动能力进行评估,每隔3日定时记录大鼠双后肢运动功能恢复情况。

1.4.3 神经电生理检测 术后30 d,每组取剩余9只大鼠,做感觉诱发电位(SEP)和运动诱发电位(MEP)检测。将受检大鼠用10%水合氯醛作腹腔麻醉,在头颅后部,消毒皮肤,切开头颅后部皮肤,剥离骨膜,用牙科钻在右侧皮层中央后回感觉区相对应的冠状缝后3mm,失状缝旁1mm处钻一盲孔;左腿部剪毛,并暴露左腿坐骨神经。用Powerlab诱发电位仪,BL-410生物机能实验系统,刺激参数:粗电压 ,强度 3V,波宽1ms,频率 10 Hz,增益 20 倍 ,滤波300Hz,时间常数0.01 s,扫描速度6.25 ms/div。检测感觉诱发电位(SEP)时,刺激电极位于坐骨神经,记录电极置于皮层,负极置于头皮下参考电极插于椎旁肌,信号计算机连续叠加100次,方能记录到该诱发电位;检测运动诱发电位(MEP)时,刺激电极与记录电极交换,参考电极位于硬腭下。所有大鼠检测完后测量其潜伏期和峰-峰值,进行统计学分析。

1.5 数据分析和处理

采用SPSS10.0统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示,组间比较采用完全随机设计资料的方差分析,检验标准P＜0.01。

2 结果

2.1 大鼠脊髓组织学观察

HE染色可以观察到假手术组灰、白质组织结构基本完整,神经细胞在灰质中分布均匀、胞体饱满、形态正常、细胞膜完整,白质内神经纤维排列整齐,细胞间质均匀。SCI组可见灰、白质组织结构不完整,损伤区灰质可见大片出血、大片坏死灶、细胞肿胀、有的出现囊腔,白质内神经纤维排列不规则(图1、2)。

2.2 大鼠行为学观察

手术前所有实验动物双后肢BBB评分均为21分。假手术组大鼠术后第1天,后肢出现短暂性活动迟缓,第2天功能明显恢复,且恢复速度很快,1周后功能恢复接近正常,BBB评分接近20分,2周后功能恢复BBB评分达到21分。说明椎板的咬除对脊髓有一定的伤害,但这种损伤程度是短暂的,轻微的,大鼠的后肢运动功能可迅速恢复。所有SCI组大鼠在撞击脊髓损伤后都出现双后肢瘫痪,只能用前肢拖着躯体移动,均造模成功。术后1周内未见功能恢复,2周开始恢复,但恢复缓慢,到第3周基本停止,只能恢复到后肢3个关节的广泛活动而不能持重行走,SCI组与假手术组有明显差异(P＜0.01),而假手术组与正常对照组3 d后对比未见差异(表1)。

图1 假手术组脊髓冠状面,HE染色×100

图2 SCI组脊髓冠状面HE染色×100

表1 各组后肢运动功能的BBB评分比较(n=12,±S)

表1 各组后肢运动功能的BBB评分比较(n=12,±S)

*P＜0.01 vs.SCIgroup;#P＜0.01 vs.Sham group

组别 3天 6天 9天 12天 15天 18天 21天 24天 27天 30天正常对照组 21*# 21* 21* 21* 21* 21* 21* 21* 21* 21*假手术组 9.42±0.37*19.56±0.76*20.13±0.82*20.88±0.11* 21* 21* 21* 21* 21* 21*SCI组 0 0.68±0.59 1.85±0.68 2.42±1.03 3.71±1.15 4.69±1.46 5.14±1.27 5.56±1.03 5.56±1.03 5.56±1.03

2.3 神经电生理检测

从表2、3以及图3、4可以看出假手术组SEP与MEP的峰-峰值和潜伏期与正常大鼠相比未见差异,说明椎板的打开对脊髓上、下行传导通路基本没有影响,而SCI损伤组可以明显看到SEP和MEP的峰-峰值急剧降低,且潜伏期明显延长,与假手术组和正常对照组相比,差异显著(P＜0.01)。

表2 各组SEP-感觉诱发电位潜伏期与峰-峰值比较(n=9,±S)

表2 各组SEP-感觉诱发电位潜伏期与峰-峰值比较(n=9,±S)

*P＜0.01 vs.SCIgroup

组别 潜伏期(mS) 峰-峰值(mV)正常对照组 2.06±0.02* 0.16±0.01*假手术组 2.05±0.02* 0.15±0.01*SCI组 5.23±0.26 0.03±0.01

表3 各组MEP-运动诱发电位潜伏期与峰-峰值比较(n=9,±S)

表3 各组MEP-运动诱发电位潜伏期与峰-峰值比较(n=9,±S)

*P＜0.01 vs.SCIgroup

组别 潜伏期(mS) 峰-峰值(mV)正常对照组 2.02±0.02* 80.79±0.55*假手术组 2.01±0.02* 80.76±0.53*SCI组 4.73±0.35 5.95±1.03

图3 各组SEP波形

图4 各组MEP波形

3 讨论

A llen's打击法以一定力量撞击脊髓后造成脊髓水肿、缺血,并继发一系列损伤反应致脊髓损伤的典型表现,这种模型比较接近人类SCI的病理生理特点及变化规律,但是也存在一定的缺点,例如在原先的Allen's打击法中,虽然模拟了致伤时的最初打击状态,却忽略了持续性的挤压作用,而在人类急性SCI往往因脊柱骨折存在着持续性的挤压作用[8]。同时因重物下坠撞击脊髓的瞬间脊柱和脊髓的不稳定及脊髓的偏向移位导致损伤的程度就有差异等。本实验改良的Allen's撞击器,击打棍直径4.0mm,击打棍套管内直径4.1mm,可以使击打棍做自由落体运动,而不会发生位置偏移,能够准确击中目标区域,击打后击打棍停留3min,与临床SCI损伤更加接近,同样的势能保证损伤程度一致;击打棍套管外侧面有刻度标记,可以调整击打棍下落高度,范围为3-10 cm,通过选择击打棍下落的高度,改变致伤势能的大小,复制出不同损伤程度的SCI模型。

目前国内外在选用大鼠作脊髓损伤模型时,损伤节段大多数选择胸段,但是在具体节段选定上,从T6-T12不一。本实验选择T10胸椎对应区,主要理由一是在临床上胸段为脊髓损伤最常见部位;二是在T10部位能够精准定位,保证模型损伤定位的一致性。在手术方法上本实验采用骨剪与咬骨钳联合“揭盖”,开骨窗的方法,这样可以很好的保护骨窗下面的脊髓,有效的避免了去除椎板过程中对脊髓造成的额外损伤,此方法操作简单,出血少,还可以保持硬脊膜的完整性,防止脑脊液外流,同时防止结缔组织、组织间液、细菌或其他有害物质的侵入。

神经电生理检查包括感觉诱发电位(SEP)和运动诱发电位(MEP),主要是反映SCI后神经传导功能。自Singer(1970)首次报道以来,诱发电位在SCI后的疗效评估及功能评定方面的重要性逐渐被人们认识[9],作为更加客观和敏感的一种检测方法已经越来越多地应用于临床SCI神经功能评价[10]。MEP是评价下行运动传导通路功能状态的敏感手段,能直接反映脊髓下行传导束或外周运动神经的功能状态,并且与下肢运动功能有较强的相关性[11];SEP反映位于脊髓背索的上行传导通路的功能状态,两者结合可有效检测脊髓损伤节段的损伤程度以及损伤后功能恢复程度。目前许多监测者采用波幅较基准下降50%,潜伏期较基准延长10%作为异常判定标准[12]。诱发电位的波幅反应诱发电位的强度,当传导束受损时,表现为波幅降低,峰-峰值减小。潜伏期反应神经纤维膜的传导功能,在传导束受损时,可以使传导速度减慢,出现潜伏期延长。本实验用SEP和MEP来检测脊髓感觉和运动传导功能,发现SCI组无论是感觉传导还是运动传导功能均未得到明显恢复,与假手术组及正常对照组相差甚远,受试大鼠MEP的结果与其后肢运动功能BBB评分一致,假手术组与SCI组的BBB评分结果相比较,具有显著性差异,而这两项结果与大鼠脊髓组织学观察结果相吻合。上述结果,为利用该改良法成功制作急性大鼠脊髓撞击损伤模型提供了实验依据。

总之,该改良法克服了Allen's打击法存在的外力作用时间不恒定、脊髓损伤程度相差大、范围不一致、打击点易偏移等缺陷。此方法能够实现定时、瞬时、定点、定高打击,操作简单,受人为因素干扰小,精确度高。只要脊髓暴露适当,打击时可以达到100%的成功率。目前应用本方法已经取得不少应用成果,本模型制作方法朝着精确、可控制、可重复及可定量的方向发展,使动物模型的建立更标准化、理想化,极大的提高了实验组间的可比性,更有利于对治疗效果的量化分析和研究比较。

[1]Baydin A,Cokluk C,Aydin K.A new minimally invasive experimental spinal cord injurymodel in rabbits[J].Minim Invasive Neurosurg,2007,50(3):170.

[2]Fukuda S,Nakamura T,K ishigami Y,et al.New canine spinalcord injury model free from laminectomy[J].Brain Res Brain Res Protoc,2005,14(3):171.

[3]A llen AR.Surgery ofexperimental lesion of spinal cordequivalent to crush injury of fracture dislocation of spinalcolumn:A prelim inary report[J].J AM Med Assoc,1911,57:878.

[4]Allen AR.Remarks on the histopathological changes in the spinal cord due to impacts:An experimentalstudy[J].JNeuNintDis,1914,41:141.

[6]Basso DM,Beattie MS,Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats[J].JNeurotrauma,1995,12(1):1.

[7]Engesser-CesarC,AndersonAJ,Basso DM,etal.Voluntary wheel running improves recovery from amoderate spinal cord injury[J].JNeurotrauma,2005,22(1):157.

[8]Delamarte RB,Sherman J,Grrr JB.Pathophysiology ofspinal cord injury.Recovery after immediate and delayed decompression[J].JBone Joint Surg,1998,77-A:1042.

[9]Cao Q,Zhang YP,Iannotti C,et al.Functional and electrophysiological changesafter graded traumatic spinal cord injury in adult rat[J].Exp Neurol,2005,191(Suppl 1):S3.

[10]Loy DN,Magnuson DS,Zhang YP,et al.Functional redundancy of ventral spinal locomotor pathways[J].JNeurosci,2002,22(1):315.

[11]胥少汀,郭世绂.脊髓损伤基础与临床[M].第2版.北京:人民卫生出版社,2002:82-231.

[12]Luk KD,Hu Y,Wong YW,et al.Variability ofsomatosensory evoked potentials in different stagesof scoliosis surgery[J].Spine,1999,24(17):1799.

Improvement and eletrophysiology assessment of the rats allen'smodel for acute spinal cord injury

LIYi-fan,CHEN Don,ZHANGDa-wei,eta l.(Norman Bethune School of Basic Medical Science,Jilin University,Changchun130021,China)

ObjectiveTo establish amore practical,standard and dependablemodel for rats acute spinal cord in jury and to lay the foundation of further research on spinal cord injury(SCI).MethodsThirty-six female ratswere randomly assigned to 3 groups(n=12 pergroup).SCIgroup:SCIwas created with amodified impingerof Allen's by a 60gcm impacting on the T10 spinal cord.Sham group:neural scutewas opened only and spinal cord was exposed without SCI.Normal control group:normal rats.Ethological observation(BBB scores)was done regularly.Histological and electrophysiological tests were done on the 30th day after operation.Resu lts HE staining resultsin Sham group and Normal control groupwere identical,butSCIgroup showed fragmented construction in greymatter and necrosis,and cellular swellingwas detected in injured region.BBB scores revealed thatnearly full functional recovery after operation in Sham group required 1Week.In SCIgroup functional recovery began in 2 ndweek after operation and stop in 3 rd week,and the scores failed toexceed 6 in the final.Significantdifference lay between Sham group and SCIgroup(P＜0.01).Electrophysiological(SEP,MEP)demonstrated that peak-to-peak value dropped sharply and latency was extended obviously in SCI group.ConclusionThismethod can be regarded as a simp ler and idealway whichwasingood reproducibility toestablish the ratsmodel for acute SCI.

Ratsmodel;Spinal cord injury;BBB score;Electrophysiology;Modification

1007-4287(2010)08-1169-04

国家自然科学基金资助课题(30970739)吉林省科学技术厅科技发展计划项目资助(20090726)

*通讯作者

R683.1;R687.32

A

2009-08-07)