氟中毒大鼠成骨细胞激活与bFGF、c-fos/c-jun表达研究

赵 军,张文岚*,张 伟,李广生

(吉林大学第一医院1.器官移植中心,泌尿外二科;2.骨科,吉林 长春 130021;3.吉林大学再生医学研究所)

氟中毒大鼠成骨细胞激活与bFGF、c-fos/c-jun表达研究

赵 军1,张文岚1*,张 伟2,李广生3

(吉林大学第一医院1.器官移植中心,泌尿外二科;2.骨科,吉林 长春 130021;3.吉林大学再生医学研究所)

目的 探讨氟中毒大鼠激活的成骨细胞系中bFGF、c-fos、c-jun的差异表达。方法应用饮水加入氟化钠进行大鼠染氟实验,采用原位杂交技术、Western blot技术、免疫组织化学方法,对氟中毒大鼠骨组织进行增殖刺激因子bFGF、c-fos、c-jun的差异表达的定量分析。结果实验表明无论是在高钙饲养还是在低钙饲养,过量摄入NaF可刺激慢性氟中毒大鼠椎骨各包被成骨细胞增殖,并诱导bFGF过表达,与对照组相比差异显著(P＜0.001);c-fos、c-jun表达明显高于对照组,差异显著(P＜0.001、P＜0.05);相关分析显示bFGF过表达与 c-fos、c-jun的蛋白质水平呈正相关。结论过量氟可以刺激大鼠成骨细胞系激活、增殖能力增强、bFGF、c-fos、c-jun表达增强,提示bFGF可能通过上调 cfos、c-jun的表达而参与成骨细胞的增殖和分化。

大鼠氟中毒;成骨细胞激活;bFGF;c-fos/c-jun

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1183)

氟化物通过促进成骨细胞系DNA合成增加,直接刺激成骨细胞系细胞增殖、增强碱性磷酸酶含量和活性,使骨钙素(ostelcalcin)增高、胶原合成增加而发挥对骨的特征性作用,其对成骨细胞的促增殖作用的分子调控机制尚不十分清楚。研究显示,在慢性氟中毒的成骨细胞激活状态伴有多种基因表达上调,参与成骨细胞的增殖和分化调节[1,2]。但是氟化物对大鼠增殖的成骨细胞碱性成纤维细胞生长因子bFGF(basic fibroblastgrowth factor,bFGF)的表达及其与原癌基因c-fos、c-jun在氟骨症中的表达的相互关系目前尚不清楚。我们采用饮水加氟进行大鼠染毒实验,观察不同饲养条件、不同浓度氟化钠(Sodium Fluoride,即:NaF)对染氟后大鼠成骨细胞系激活状态bFGF、c-fos和c-jun的表达水平并进行相关分析,据此探讨慢性氟中毒骨相损害相关的基因调节的分子基础。

1 材料与方法

1.1 动物分组与处理

实验动物系白求恩医科大学实验动物部提供的封闭群动物Wistar大鼠72只,雌雄各半,体重120g左右。随机分为高钙和低钙两大组。高钙大组又分为高钙加氟组(饮水加F-100mg/L)和高钙对照组,每组24只;低钙大组又分为低钙加氟组(低钙饲料饮水加F-50 mg/L)和低钙对照组,每组12只。高钙组用白求恩医科大学实验动物部提供的富钙平衡饲料;低钙组用自制低钙饲料喂养,饮水采用长春自来水,其含氟量忽略不计。含氟(F-)水的配制:100mg F-/L含氟(F-)水每升水投分析纯氟化钠221.0mg。实验期间动物自由摄食、进水,实验周期20周[1]。

1.2 试剂

兔抗大鼠bFGF、c-fos、c-jun多克隆抗体购自Santa Cruz Bitechnology公司。

1.3 检测指标及方法

取慢性氟中毒大鼠脊椎骨4%多聚甲醛固定,薄切3-4μm。HE染色、应用免疫组织化学法检测检测成骨活动的骨内膜包被、皮质骨内包被(哈佛管包被)和骨小梁包被的成骨细胞系bFGF、c-fos、c-jun的差异表达。取液氮快速冷冻、-80℃保存的骨外膜包被组织,采用改良Western blot法检测bFGF、cfos、c-jun蛋白质表达。应用图像分析仪(HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统)对实验结果进行吸光度值测定、定量分析。实验数据采用SPSS 11.0统计软件进行方差分析和 q检验和相关性(Pearson Correlation)分析。

2 结果

2.1 成骨细胞系激活与增殖活跃

本实验侧重观察大鼠腰椎的改变。椎骨在解剖学上属于不规则骨,即软骨内成骨的骨骼。加氟后大鼠骨病变为以成骨功能活跃为主的骨转换加速,伴破骨性骨吸收增强改变,且以低钙加氟组病变比较明显。主要表现为:骨外膜内层(即骨外膜包被)细胞增生活跃,细胞层数增多(图1);连续骨板的表面以及骨小梁表面可见骨样组织增多和小梁周围纤维化(图2)。长骨(胫骨)可见破骨细胞增多、骨吸收增强和骨干部密质骨松质化(图3),而在脊椎骨则表现很轻微。在脊椎仅见骨小梁周围纤维化,而在长骨则骨髓纤维化很明显(图4)。

图1 低钙+F-(50mg/L)(HE 200×)

图2 低钙+F-(50mg/L)(HE 200×)

图3 低钙+F-(50mg/L)(HE 200×)

图4 低钙+F-(50mg/L)(HE 200×)

2.2 bFGF在成骨细胞的表达

应用免疫组织化学方法在氟中毒大鼠脊椎骨骨小梁表面成骨细胞、骨内膜成骨细胞bFGF阳性表达,位于成骨细胞胞浆和胞核(图5)。图象分析显示,偏食低钙组大鼠与对照组相比差异显著(P＜0.01,见表1)。并且,在骨外膜检测到bFGF蛋白,采用改良Western blot法[7]检测证明,在骨外膜成骨系细胞bFGF为两条分别为16 KD和17 KD的阳性蛋白带(图6)。氟中毒大鼠骨外膜成骨系细胞bFGF蛋白表达明显高于对照组(P＜0.01),有显著意义(见表1)。

表1 大鼠成骨细胞bFGF蛋白表达(吸光度值 ±s)

表1 大鼠成骨细胞bFGF蛋白表达(吸光度值 ±s)

注:与各自对照组相比,**P＜0.01

组别 鼠数 免疫组化 Western blot高钙对照 6 156.15±4.94 131.03±1.73高钙加氟 6 142.40±13.95 120.76±1.62低钙对照 5 158.33±3.58 130.18±2.76低钙加氟 7 141.80±4.11** 116.24±6.61**

2.3 c-fos、c-jun在成骨细胞系的表达

应用免疫组织化学方法在氟中毒大鼠脊椎骨骨小梁表面成骨细胞、骨内膜成骨细胞c-fos/c-jun阳性表达,位于成骨细胞胞浆和胞核(图7、8),Western blot法,检测到骨外膜组织c-fos(62kD)和 c-jun(39 kD)蛋白的阳性杂交带,统计分析证明c-fos、c-jun基因产物在氟中毒大鼠成骨细胞系均明显高于对照组,差异显著(P＜0.05或P＜0.001,见表2、3)。

表2 免疫组化氟中毒大鼠成骨细胞c-fos和 c-jun蛋白质水平(吸光度值 ±S)

表2 免疫组化氟中毒大鼠成骨细胞c-fos和 c-jun蛋白质水平(吸光度值 ±S)

与各自对照组比较,*P＜0.05;**P≤0.001

组别 鼠数 c-fos c-jun高钙对照 6 152.93±6.15 155.33±3.99高钙加氟 6 140.73±13.57* 134.03±7.87**低钙对照 5 149.98±8.31 149.19±11.97低钙加氟 7 132.46±2.59** 129.79±14.91**

表3 骨外膜成骨系细胞c-fos/c-jun蛋白质水平(吸光度值 ±S)

表3 骨外膜成骨系细胞c-fos/c-jun蛋白质水平(吸光度值 ±S)

注:与各自对照组比较,*P＜0.05;**P≤0.001

组别 鼠数 c-fos 鼠数 c-jun高钙对照 4 130.48±3.09 6 127.70±2.56高钙加氟 5 123.32±4.29 6 116.60±8.04**低钙对照 5 127.98±3.10 5 126.32±5.10低钙加氟 6 115.97±7.19* 7 108.30±7.34*

2.4 bFGF表达与c-fos、c-jun的关系

采用SPSS统计软件之Pearson correlation法对骨外膜成骨系细胞bFGF蛋白质表达和c-fos蛋白质水平进行相关分析,结果显示两者在蛋白质表达水平呈正相关(r=0.543),有显著相关性(P＜0.05);同样,骨外膜成骨系细胞bFGF蛋白质表达和c-jun蛋白质水平相关分析显示,两者在蛋白质表达水平呈正相关(r=0.728,P＜0.01)。bFGF和其他多肽类生长因子都具备上调原癌基因表达的作用,在氟化物作用下,bFGF可能通过上调c-fos基因表达水平而参与成骨细胞增殖调节。

图5 bFGF在氟中毒大鼠成骨细胞系的表达(DAB显色×200)

图6 Westren b lot检测骨 外膜bFGF表达

图7 c-fos在氟中毒大鼠成骨细胞系的表达(DAB显色×200)

图8 c-jun在氟中毒大鼠成骨细胞系的表达(DAB显色×200)

3 讨论

3.1 慢性氟中毒成骨细胞功能活跃

慢性氟中毒的骨骼病变复杂多样,成骨细胞功能活跃是一个发生较早并起主导作用的环节[3]。氟增加骨形成是通过促进成骨细胞增殖、增加类骨质沉积而实现的。氟在不同种属动物和人类有促进成骨细胞有丝分裂的作用。在本研究结果中观察到氟中毒状态下成骨细胞处于激活状态。在慢性氟中毒大鼠脊椎的各包被中,均可见成骨细胞系的增殖活跃和成骨细胞的胞体肥大、排列密集[1]。表明过量氟作用下成骨细胞激活是慢性氟中毒氟骨症发生的重要原因。

3.2 FGF与成骨细胞增殖分化调节

FGF超家族为正常骨骼发育所必需,骨细胞可合成酸性(a-)和碱性(b-)FGF,这两种形式在骨细胞生长中起重要作用。FGF受体点突变可以引起软骨发育不全、Grouzon骨病等。aFGF和bFGF都能促进骨细胞的分裂增殖,bFGF还影响骨细胞的表型,增加骨细胞BGP含量、抑制成骨细胞和骨髓干细胞凋亡,具有促进骨形成作用[4-6]。也能抑制ALP活性和减少胶原的合成,bFGF因其含量高,在骨代谢中起更重要的作用。bFGF可由成骨细胞自身合成表达,以自分泌和旁分泌方式起作用,或于骨基质中延迟发挥作用[7,8]。FGF可以促进骨细胞成活,抑制骨细胞凋亡。协同促进骨桥蛋白表达(osteopontin),诱导碱性磷酸酶,形成细胞外基质(ECM)的反馈调节,控制成骨细胞增殖及成骨活动的有机调节[9]。动物实验中,FGF不仅可以阻止由雌激素水平降低引起的骨丢失,还可以使稀疏、排列紊乱的骨小梁更加丰实、有序;也能增加骨的吸收并诱导成骨细胞合成间质胶原酶,体外抑制胶原的降解和OA患者软骨组织中软骨细胞分化,与前列腺素E2协同作用防止骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者的胶原蛋白退化[10]。新近的研究表明bFGF具有明显的调节骨细胞增殖和矿化过程增强骨形成[4,5]。FGF成员在氟骨症病理过程中表达如何,目前尚少见报道。本研究发现在氟中毒大鼠脊椎骨成骨细胞及骨外膜成骨系细胞有bFGF蛋白呈过表达,与对照组相比差异明显。说明过量氟化物激活成骨细胞的过程中有bFGF参与。我们还发现bFGF蛋白表达与c-fos、c-jun的蛋白质水平呈正相关,提示bFGF可能通过上调c-fos、c-jun的表达而参与成骨细胞的增殖和分化。在小鼠转入人金属硫蛋白启动子(metallothionein promoter,MT),出现 c-fos基因过表达后,出现干骺端膨大、骨髓纤维化和明显的新骨形成等一系列骨病变[11]在某种程度上与氟骨症的骨相改变有很大的相似之处[1]。在过量氟作用条件下c-fos基因活化引起的骨相改变与在成骨细胞bFGF基因活化且过表达呈正相关关系。

氟骨症的骨相损害是在F-的丝裂原作用下发生的由多种调节因子参与介导的骨转换异常的复合损伤过程,其发生机制涉及的信号传导与增殖调节的不同环节,成骨细胞功能活跃是氟骨症发病的重要环节,本研究发现bFGF不仅在氟中毒大鼠骨内膜、骨小梁表面的成骨细胞有过表达,而且在骨外膜成骨系细胞有明显过表达,提示在氟化物作用下,成骨细胞激活过程确有bFGF表达增强参与刺激成骨细胞增殖分化调节。有关bFGF基因参与调节的确切机制尚需进一步研究。

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To study the expression of osteoblasts activation and bFGF,c-fos/c-jun in fluorosis rat

ZHAO Jun,ZHANGWen-lan,ZHANG Wei,etal.(Departmentof Transplant Center and Second Urology,The First Hospitalof Jilin University,Changchun130021,China)

ObjectiveTo study the differenceexpression of bFGF,c-fos,c-jun in activation osteoblastsof fluorosis rat.MethodsRat flurosismodelwasmadeby driking waterwith fluroride sodium(NaF),the differenceexpression ofbFGF,c-fos,c-jun in activation osteoblastswere analyzed quantitatively by hybridization in situ,Westernblotand immunohistochemistrymethods.ResultsNaF could stimulate the proliferation of periostealenvelop osteoblast in ratwith flurosiswhether highor low caicium group,induced the over expression of bFGF and wereobvious statistic significance compared with control group(P＜0.001).The expression of c-fos/c-jun werehigher and obvious statistic significance compared with control group(P＜0.001,P＜0.05).The analysis show that theexpression ofbFGF is rational correlationwith the protein expression of c-fos,c-jun.ConclusionExcessive fluoride could stimulate the activation of ratosteob last,increase the proliferation and increase the exp ression of bFGF,c-fos,c-jun.It suggested thatbFGFmaybe take part in the proliferation differation through increasing the expression of c-fos,c-jun.

Fluorosis rat;Osteob lasts activation;bFGF;c-fos/c-jun

R992

A

1007-4287(2010)08-1183-04

国家自然科学基金重点项目(39730390)

*通讯作者

赵军(1964-),女,医学硕士,主治医师,讲师,主要从事免疫学分子生物学研究。

2009-10-13)