浅析巴斯德毕赤酵母表达系统的研究

王 艳 （山东省枣庄市畜牧兽医局 277800）

对于一个有商业潜质和广阔市场前景的兽用蛋白质类药物的研究，主要是要寻找一条稳定的工艺条件和获得较高的工作效率，巴斯德毕赤酵母表达系统就具有这方面的优点，其优越性表现在：分泌性表达，不需要复性，有效率为100%，纯化程序简单，大大降低了生产成本，尤其适用于动物干扰素的表达。

1 巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)表达系统的特点

巴斯德毕赤酵母是近年来兴起的一个真核高效表达系统，具有许多独特的优点，已迅速发展成为分子生物学领域中被广泛用于重组蛋白生产的主要表达系统之一[1]。Pichia Pastoris是一种噬甲基酵母，可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中快速生长。它含有两个基因编码醇氧化酶(alcohol oxidase,AOX)—AOX1和AOX2，两者序列相似，有92%的同源性，其编码蛋白有97%的同源性和几乎相同的特异催化活性。但在细胞中乙醇氧化酶的主要活力由AOX1提供，AOX2提供乙醇氧化酶的活力很低。在以甲醇作唯一碳源的培养基上，含有AOX1的酵母菌株生长表现为正常野生型Mut+，如果AOX1基因遭到破坏或被替换，只有AOX2的酵母菌株利用甲醇的能力减弱，则表现为生长缓慢性MutS。

根据其生物学特性和遗传学特征，P.pastoris作为外源蛋白表达系统非常成功，总结如下[2]：（1）酵母属于单细胞微生物；保留了细菌的特点，其营养要求简单，生长快；操作方便易于培养，低成本，高密度，发酵技术也已非常成熟。（2）酵母是低等真核生物，不产生有毒物质，毒性比细菌小。（3）酵母具有真核生物的亚细胞结构，可进行很多典型的高等真核生物的蛋白翻译后加工修饰；如糖基化、脂酸化、磷酸化以及蛋白裂解、折叠、二硫键的形成等。（4）Pichia Pastoris的分子生物学操作技术与酿酒酵母(S.cerevisiae )非常相似，而后者的遗传背景和生理特性研究得比较透彻，是应用很广泛的表达系统之一。（5）在醇氧化酶1(AOX1)基因来源的强启动子的严格调控诱导下，无论胞内还是分泌，均可实现外源基因的高表达，而且产物易于纯化，特别是高分泌性的外源蛋白占所有被分泌蛋白的30%以上，容易分离，适于商业生产[3]。

2 巴斯德毕赤酵母的表达载体

由于巴斯德毕赤酵母没有稳定的附加载体(stable episomal vecters)，所以一般用整合型载体也称穿梭载体作为外源基因的表达载体。即几乎所有的毕赤酵母表达载体都设计为穿梭载体，即在酵母和大肠杆菌中都能复制的载体，包含大肠杆菌的质粒复制源和氨苄青霉素抗性基因。它可以在大肠杆菌中保存、扩增、和构建，线性化后转入酵母细胞，使用方便。它有胞内表达载体如pPIC3、pPSC3k等和分泌性表达载体如pPIC9、pPIC9K等两种类型，都有一些共同的结构，例如：AOX1基因的5′AOX1启动子，编码N端分泌信号(SIG)，多克隆位点(MCS)，转录终止和PolyA形成基因(TT)，3′AOX1序列，3′AOX1终止序列，筛选标记等等[4-6]。

3 巴斯德毕赤酵母的表达蛋白质的糖基化

该表达系统不存在原核表达系统的内毒素难以去除的问题，也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体的污染等问题，毕赤酵母能对表达的蛋白质进行N-和O-糖基化[7]，其中N-糖基化对于许多蛋白质的正确折叠、药物动力学稳定性和功能是必需的，人们对其研究也相对深入。但是并不是说所有的潜在的糖基化位点均会发生糖基化。当蛋白质含有一致性序列Asn-Xaa-Thr/Ser(Xaa代表任何氨基酸)时，毕赤酵母能对其中的天冬氨酸残基上的酰胺氮进行糖基化，产生N-糖基化。毕赤酵母能对蛋白质中苏氨酸和/或丝氨酸上的羟基进行糖基化，产生O-糖基化。糖基化对重组蛋白质的产量和功能的影响因蛋白质而异，原因尚不明确。

4 提高外源蛋白在巴斯德毕赤酵母表达系统中的表达量的策略

要想实现外源蛋白在该系统的高效生产，就必须在实验设计和具体操作中从下列环节予以重视，尽可能达到最优化。（l）应对所要表达的外源蛋白及其基因的结构、功能和特性有较全面、细致的了解；（2）注意信号肽的选择，可以采用目的基因的信号肽，也可选择载体自身的信号肽，但二者对蛋白的分泌效果不尽相同；（3）选择合适的载体及合理的载体构成方式；（4）选择恰当的受体菌，如带有抗性标记、多拷贝筛选标记、蛋白水解酶缺失株等，既利于操作，有利于高效生产；（5）改进转化方法与筛选鉴定方法，由于表达单位的不同整合方式、拷贝数、阳性转化子，表达量的特异、快捷鉴定方法对获得高表达株有重要意义[8]，因此应采用即操作简便又可提高转化率和表达单位拷贝数的方法，通常利用原生质法、电转化法等，可根据实验条件具体选择；（6）采用较好的培养基和适宜的生长条件；（7）注意摸索诱导发酵参数，采用现代的发酵工艺，如目前的批量表达与连续灌注发酵罐。总之，虽然 P.pastoris表达系统是一个较好的被广泛应用的真核表达系统，但是由于天然蛋白质的复杂性和多样性，以及外源基因与酵母基因组重组情况的某些不可预知性，使得特定的外源基因的高效分泌表达并不可能一蹴而就，尚有许多的条件需要具体的摸索、尝试和优化。

[1]Hollenberg C P.Gellissen G.Production of recombinant proteins by methylotrophic yeast[J]. Curr Opin Biotechnol,1997,8(5):554-560.

[2]丁云菲, 刘勇, 戴长柏.巴斯德毕赤酵母研究进展[J].生命科学, 2003,15(1): 26-30.

[3]张平武,李育阳.新型酵母表达系统的研究[J].生物技术通讯,1999,10:306-309.

[4]马兴元,谭建华,朱平等.巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)表达系统及其在外源蛋白生产中的优势与应用前景[J].中国兽医学报, 2003,23(1):98-101.

[5]Koti S,Robert G B,Keith E K,et al.Strategies for optimal systhesis and secretion of heterologous proteins in the methylotrophic yeast Pichia Pastoris[J].Gene,1997,190:55-62.

[6]Thomask K,Frost PA,Morten H.Secretory expression and characterization of insulinin Pichia Pastoris[J].Biotechnology Applied Biochemistry,1999,29(1):29-86.

[7]Nohr J et al.Methods Mol Biol,2003,232:111-125.

[8]Vassileva A,Arora Chugh D,Swam inathan S,et al.Effect of copy number on the expression levels of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast Pichia Pastoris[J].Protein in Expr Purif, 2001,21(1):71-80.