膜联蛋白在动脉粥样硬化中的研究进展

邬 强 综述，钱士匀 审校

（海南医学院热带医学与检验医学院，海南 海口 571101）

膜联蛋白亦称为钙磷脂结合蛋白，是一类依赖Ca2+的膜磷脂结合蛋白超家族，广泛分布于各种真核细胞膜、细胞质和细胞外，约占细胞总蛋白质的2%左右[1]。其家族各成员结构上具有极高的同源相似性，C端均由约70个氨基酸残基组成的4个(Annexin A6为8个)保守重复序列，构成独特的Ca2+-膜结合中心结构域，使之可逆性锚定于细胞膜上。家族中不同的膜联蛋白成员N端序列长度不同，各具独特的基因表达方式和组织特异性，表明特异的N端区域与各种膜联蛋白的特异功能有关[2]。膜联蛋白更易于与酸性磷脂结合，尤其是磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酸，不同的膜联蛋白在机体的不同组织和部位执行着不同的生物学功能。

1 膜联蛋白家族组成、结构及生物学功能

自1977年膜联蛋白首次发现以来，其家族成员不断增加，现有超过1000种不同的基因表达产物组成，广泛存在于不同门、种的大多数真核生物细胞（动物、植物、真菌）中，物种间高度保守[3]。目前膜联蛋白超家族可以分为A、B、C、D、E 5个家族，A族主要存在于脊椎动物细胞，已确定有12个成员(Annexin A1-A11，Annexin A13)。人膜联蛋白基因大小从15 kb(Annexin A9)到96 kb(Annexin A10)不等，定位于1、2、4、5、8、9、10及15号染色体上。大多数家族成员分布于细胞内、细胞膜，而Annexin A1、Annexin A2及Annexin A5等也在细胞外有发现，如存在于血液中[4]。由于缺乏信号肽结构，膜联蛋白如何转运出细胞的机制尚不清。

膜联蛋白结构上包括C端中心结构域和N端结构域。X射线晶体衍射实验发现其中心结构域大多由5个α螺旋形成的圆盘状结构组成，凸面包含膜磷脂结合位点及2个典型的Ca2+结合位点，面向细胞膜。不同膜联蛋白的中心结构域大约有50%的氨基酸序列同源。N端位于圆盘结构的凹面，游离延伸与中心结构域相互作用，调节其稳定性。影响Ca2+依赖的圆盘凸面与带负电荷的膜磷脂结合，另外还包括蛋白水解位点、磷酸化位点及细胞质蛋白结合位点，为膜联蛋白的调节区。在未结合Ca2+时，N端藏于中心结构域内，结合Ca2+后，N端暴露于分子外[5]。

近年来，国内外通过基因抑制(Gene Knockdown)、基因敲除(Gene Knockdown)、RNA干扰(RNA Interference)及显负性突变体(Dominant negative mutant)等方法研究发现膜联蛋白具有多种生物学功能，在细胞中参与膜转运及膜表面一系列依赖于钙调节蛋白的活动，包括囊泡运输、胞吐作用中的膜融合、信号转导和钙离子通道的形成、调控炎性反应，参与凝血过程，参与细胞凋亡、细胞分化和细胞骨架蛋白间的相互作用等[6]。膜联蛋白与人类许多疾病的发生发展相关，尤其在心血管疾病、肿瘤、炎症、糖尿病及自身免疫病中的作用机制成为当前的研究热点。某些膜联蛋白的表达和活性失调可以引起人类多种疾病，并可导致“膜联蛋白病”。目前每种膜联蛋白的具体生物学功能尚不十分清楚。

2 动脉粥样硬化(AS)的发生、发展机制

AS及其并发症是当今世界上导致死亡的最常见的病因之一，是由多种遗传因素和环境因素共同作用的结果。AS的发生发展包括脂质入侵、血小板活化、内膜损伤、炎性反应、氧化应激、血管平滑肌细胞激活、血栓形成、选择性基质代谢及血管重建等[7]。AS发病机制有多种假说，但均不能单独彻底阐明其确切病因及发病机制。

近年来多数学者接受“AS是一种多因素导致的慢性炎症反应性疾病”的学说，即“炎症诱发的内皮损伤反应学说”，认为AS形成的基本过程为：在长期高脂血症的影响下，增多的脂蛋白尤其是氧化修饰的低密度脂蛋白和胆固醇对动脉内膜造成功能性损伤，使内皮细胞和白细胞表面发生特征性改变，粘附分子表达增加，使单核细胞粘附在内皮细胞上的数量增多，并从内皮细胞之间迁移至内膜下成为巨噬细胞，通过清道夫受体吞噬氧化的低密度脂蛋白后，转化为泡沫细胞，形成最早的粥样硬化病变脂质条纹，同时平滑肌细胞纤维化增生，促使脂质条纹演变成纤维脂肪病变，最终发展成为纤维斑块，即AS斑块，使动脉壁变硬、管腔狭窄[8]。AS发生发展的整个过程都有炎性因素的参与，存在一系列炎症级联免疫反应，炎症细胞尤其是单核细胞与内皮细胞粘附并迁移至内皮下演变为巨噬细胞是AS的关键环节之一[9]。

细胞凋亡是AS病变的独立危险因素，贯穿于AS发生、发展的全过程。细胞凋亡和细胞增殖的平衡决定了AS的进展，其参与了血管内皮的损伤、血栓的形成和平滑肌细胞凋亡后的纤维化所致肌层的增厚、血管重建以及细胞凋亡后AS斑块的脱落等病理改变。细胞凋亡直接影响粥样硬化动脉的形态和结构，以及AS斑块的稳定性。AS斑块内细胞过度凋亡，在促进不稳定斑块形成的过程中起着重要的作用[10]。

3 膜联蛋白与AS的关系

Annexin A1又称为脂皮素(LipocotinⅠ)、依钙蛋白(CalpactinⅡ)、磷脂酶A2(Phospholipase A2，PLA2)抑制蛋白，在机体多数组织尤其是粒细胞、单核细胞中呈强阳性表达。Annexin A1是一个重要的炎症调控蛋白，在炎性代谢产物产生、中性粒细胞/单核细胞与内皮细胞粘附的过程中起重要作用[11]。在炎症反应中Annexin A1对中性粒细胞和单核细胞迁移都有强大的抑制效应，这一作用与甲酰基肽受体(FPR)和Lipoxin A4受体(ALXR)的激活、L-选择素(L-Selectin)的脱落、整合素(Integrin)α4β1的竞争性结合和N-聚糖羧化有关[12]。外源性Annexin A1以及内源性Annexin A1外化与血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)竞争与整合素α4β1结合，抑制单核细胞与血管内皮细胞的粘附，参与早期炎症反应的调节[13]。Annexin A1的抗炎症作用还主要体现在它对PLA2的抑制作用，PLA2是炎性介质合成释放的关键酶，是调节炎性反应的中心[14]。Annexin A1也抑制其他一些参与炎症反应的酶表达和活性，如诱导型一氧化氮合酶和环氧化酶2等[15]。他汀类药物可以影响外周血单核细胞抗炎蛋白Annexin A1的表达，随着其剂量增加Annexin A1表达水平显著增加，发挥其抗炎作用，并进一步发挥抗AS作用。Annexin A1表达的改变能够影响caspase-3的活化和Ca2+释放，从而促进细胞凋亡。外源性的Annexin A1可通过提高胞内Ca2+浓度和相关凋亡促进因子的去磷酸化而诱导细胞凋亡[16]。

Annexin A2蛋白主要表达在人体内皮细胞、单核/巨噬细胞、骨髓细胞和某些肿瘤细胞中，在细胞膜构架的形成、膜聚合、内吞和胞吐过程中均起重要作用，还参与多种病理过程。细胞表面的Annexin A2蛋白可作为受体，参与纤溶、细胞粘附、配体介导的信号转导及病毒感染等生理过程。Annexin A2蛋白在细胞膜表面结合组织纤维蛋白溶解酶原激活因子和纤溶酶原，介导纤溶蛋白酶的生成，增强纤溶酶催化效率，影响凝血机制[17]。通过促进内皮细胞的纤溶活性，降低血液黏稠度及AS的发生率。另外有研究表明，在H2O2或肿瘤坏死因子α(TNF-α)引起的过氧化应激反应中，Annexin A2是胞内应激反应时谷胱甘肽化的主要靶点。Ling等人研究发现Annexin A2的异四聚体还具有还原纤维蛋白溶酶的活性，可通过破坏纤溶酶原中的二硫键使其释放A61片段[18]。AS发展过程中，由于脂蛋白(a)的影响，Annexin A2促纤溶作用减弱；脂蛋白(a)含纤溶酶样载脂蛋白A，可结合低密度脂蛋白；脂蛋白(a)抑制纤溶酶原结合到Annexin A2分子上，降低纤溶酶产生，导致纤维蛋白溶解障碍，促使进行性AS的发生。同型半胱氨酸可竞争性抑制组织纤维蛋白溶解酶原激活因子与Annexin A2的结合，从而减少纤溶酶的产生，影响正常纤溶而使体内形成血栓[19]。Annexin A2也具有Annexin A1对PLA2的抑制作用而抗炎症，且四聚体形式的抑制作用更强。

Annexin A5最早由胎盘中分离得到，具有与Annexin A2同样的抗凝及抗炎症作用。Annexin A5抗凝功能主要通过有序地排列在细胞膜磷脂表面，形成屏障阵列，遮盖血液凝固所需的磷脂，并可以从磷脂表面转移凝血因子。一旦Annexin A5在细胞磷脂膜表面形成的这一屏障被破坏，则容易发生血液凝固。细胞凋亡时细胞膜表面暴露磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)，为血液凝固提供了催化表面，从而加速血栓形成[20]。Annexin A5是抗磷脂抗体所针对的重要自身靶抗原之一，抗磷脂综合征(APS)血栓形成机制的研究表明，Annexin A5与带阴离子的磷脂结合，抑制了磷脂依赖凝血复合物的形成，而抗磷脂抗体对Annexin A5的识别，导致Annexin A5与磷脂之间亲和力的下降，加速凝血，促进血栓形成[21]。在Ca2+存在的条件下，Annexin A5对PS具有高度亲和力，作用位点是第187位的色氨酸。PS从细胞膜的脂双层内层迁移至外层是细胞凋亡级联反应的初始事件，利用两者这种高亲和力特性，很多研究者将标记有荧光素(如FITC、PE)或生物素的Annexin A5作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜检测凋亡细胞的发生[22]，而且利用放射性示踪技术对Annexin A5进行放射性核素标记后(常用碘或99mTc)，通过与PS的结合可非侵入活体检测细胞凋亡，用于检测AS的发生[23]。这个中间物质呈像的技术可以定量反映AS斑块的组成、代谢及发展趋势，可早期发现AS的发生，采取措施控制AS的进一步发展。

Annexin A7在体外能聚集嗜铬颗粒，因而是第一个被分离的膜联蛋白家族成员。除肾上腺髓质外，已在许多哺乳动物组织中检测到Annexin A7，包括脑、肝脏、腮腺、脾、肺及骨骼肌。Annexin A7参与膜运输、细胞分泌、钙离子动态平衡及肿瘤抑制等多种生物学功能。凋亡发生时，细胞内Annexin A7的含量降低，在凋亡因子刺激下Annexin A7的下调可阻止半乳凝素-3发挥抗凋亡作用[24]。

4 结论

尽管膜联蛋白具有多种生物学功能，但除Annexin A1在炎症，Annexin A2在糖尿病中的作用机制，大多具体机制尚不清晰。目前尚无疾病证明直接与特定的膜联蛋白功能丧失有关，但其必定在多种疾病及病理过程中发挥重要的作用。在AS的发生、发展中，膜联蛋白很可能参与了多个过程，但需要进行大量的研究来阐明其具体机制。相信这些“老分子”必将成为AS研究领域的“新角色”。

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