噬菌体展示肽库技术的研究及应用进展

郑俊梅 张映

1985 年，Smith[1]将RI核酸内切酶基因克隆到丝状噬菌体fd的外壳蛋白基因Ⅲ中，并成功地得到了在外壳蛋白中融合表达了酶分子的噬菌体粒子。该噬菌体能够被EcoRI核酸内切酶抗体有效中和，说明展示在噬菌体外壳表面的酶分子与天然酶分子有着相同或极为相近的构象和活性。这一实验的成功标志了噬菌体展示技术的诞生。噬菌体展示的基本概念是将外源蛋白质或多肽的基因表达产物与噬菌体衣壳蛋白融合，并在其表面展示，进而通过筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，得到大量富集，然后进行DNA序列测定。这个技术的最大优点是直接将表达型与其基因型联系在一起，再利用其配体的特异性亲和力，将有需要的蛋白质或多肽挑选出来。它实现了基因型和表型的转换，提供了高效率的筛选系统[2]。因而在抗原表位的模拟、蛋白质工程的改造、单克隆抗体的制备、药物筛选及疫苗研制等方面，具有广泛的用途。

1 噬菌体展示肽技术的基本原理

噬菌体展示肽技术主要是以丝状噬菌体为载体进行的。丝状噬菌体是一类包括M13、fd和f1在内的雄性噬菌体，侵染F+大肠杆菌。它们的基因组包括约6400个碱基，编码10种蛋白，其中由gⅧ编码的主要外壳蛋白 (maior coat protein)PⅧ和gⅢ编码的次要外壳蛋白 (minor coat protein)PⅢ为常见融合位置[3-4]。噬菌体展示技术就是通过将外源基因插入到丝状噬菌体编码外壳蛋白的gⅧ和gⅢ中而得到表达，表达的多肽可以融合蛋白的形式连接在PⅧ和PⅢ的N端，在噬菌体表面独立展示其结构而不影响噬菌体的完整性和活性。自从丝状噬菌体展示技术问世以来，这两种展示系统被广泛应用于多种研究用途的肽库的构建。

如果将丝状噬菌体的复制起点引入大肠杆菌的质粒载体中，该质粒即能以单链DNA的形式包装在噬菌体的外壳中，这段单链质粒DNA称为噬菌粒[5]。噬菌粒展示系统比常规噬菌体展示较少的肽，因此在筛选高亲和力的展示肽时有更好的优势，但这种展示系统由于需要辅助噬菌体协助感染，而辅助噬菌体有时不稳定，因此使这种展示系统的应用受到了一定的限制。

尽管丝状噬菌体展示系统的优点显著，但由于其系统的一些内在限制而不能展示细菌细胞的毒性蛋白或肽。1994年，Maruyama[6]等人将λ噬菌体尾丝蛋白PV切开并将外源蛋白插入其中，从而将该蛋白展于λ噬菌体的外壳上。由于毒蛋白的合成在细胞的溶源状态下会受到抑制，在细胞裂解前很短一段时间才得以诱导，而且λ噬菌体展示肽不必经过蛋白分泌，而是在细胞内进行装配，随细胞裂解释放，因此λ噬菌体展示系统可以很好地解决毒性蛋白的展示问题。

2 噬菌体展示肽库的构建

目前，肽库的构建主要有两种途径：一是有机合成法，二是基因合成法。前者是直接用固相肽合成技术，合成含有各种可能序列的短肽。该方法的优点是构建方法简单迅速，可以引入D型氨基酸和非天然氨基酸以及特异的二级结构短肽，库的大小以及肽的长度在理论上不受限制。其缺点是：不能扩增，筛选较麻烦，需进行荧光标记或ELISA分析。基因工程方法是将编码各种序列特定长度短肽的目的基因克隆进表达载体(fuse phage)，与噬菌体的外壳蛋白基因融合表达，使得一个噬菌体上含有一种序列的肽。与有机合成法相比较，该方法有其独特的优越性：它可将特定分子的基因型和其表型统一在同一个病毒颗粒内，并且将选择能力和扩增能力联系在一起，即通过与配体的结合从数量众多的多样性群体中选择出表达有相应配体的噬菌体颗粒，再通过感染大肠杆菌使选择出的噬菌体颗粒得到扩增。其不足在于肽库的容量及短肽的大小受到了限制，且只能表达L型天然氨基酸形成的短肽。

3 噬菌体肽库的筛选技术

如何从噬菌体肽库中筛选到特异的重组噬菌体是肽库技术的关键。经典的方法有两种：①将纯抗体包被在固相介质上，如酶标板、免疫试管或亲和层析柱，然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体；②将抗体与生物素基因相连，再将其固定在包被有Streptavidin的磁珠上对噬菌体进行筛选。

3.1 宿主菌直接洗脱

经典筛选过程中，一般利用 pH的变化来洗脱与目标分子结合的噬菌体，这可能对噬菌体造成伤害。利用噬菌体与宿主之间的亲和性可以直接用宿主菌来洗脱，以避免对筛选的影响，并且将洗脱和感染合并到一步[7]。

3.2 双层膜筛选系统

获得重组噬菌体蛋白的方法是将筛选出的特异噬菌体转入不含校正基因的菌株，将外源蛋白以可溶性蛋白的形式表达出来。通过细胞膜间隙最终进入培养基质中。针对这种情况，Skerra等[8]建立了双层膜筛选系统。第一层膜为亲水性多孔膜，这种膜对蛋白质的结合能力小，孔径能让蛋白质分子自由通过，但细胞不能通过；第二层膜为疏水膜，膜表面包被目标蛋白(抗原或抗体)，两种膜分别覆盖在固体培养基上。细胞在第一层膜上培养一段时间后，将这层膜转移到第二层膜上培养，分泌的可溶性蛋白透过第一层膜，与第二层膜上的目标蛋白结合，然后再用已知的抗原或抗体筛选。这种方法避免了蛋白常遇到的细胞碎片的干扰，提高了筛选效率。

3.3 选择性感染噬菌体筛选系统

传统的筛选系统中基因重组的噬菌体仍有野生型的geneⅢ蛋白的存在，因重组噬菌体具有感染能力，这导致在筛选后扩增时特异性和非特异性的噬菌体均可以进入宿主菌增殖。选择性感染噬菌体筛选系统把筛选和扩增合并为一步，只有特异性的噬菌体才能感染宿主菌扩增，而非特异性噬菌体却不能。此筛选系统是以噬菌体感染宿主菌的机理为基础，其基本原理是把其中之一用特定的多肽或蛋白替代，使噬菌体丧失感染力，再通过这些多肽与其配基的结合恢复感染能力。这样只有特异性的噬菌体可以通过配基配体结合才能恢复感染能力，进入宿主菌细胞内繁殖[9]。具体的做法有两种，其一是将噬菌体所有 PⅢ外壳蛋白的 N端用所展示的多肽或蛋白取代，使其丧失感染能力，再把与所筛选的目的多肽或蛋白的特异配基同 PⅢ蛋白的 N端相连作为筛选的探针，只有特异性噬菌体才能与连接有 PⅢ蛋白 N端的配基相结合，这种结合使噬菌体重新具有 PⅢ蛋白的 N端，因而具有感染力；其二是将作为配基的多肽或蛋白融合在 E.coli的纤毛上，这样纤毛失去了介导的能力，只有特异性的噬菌体可与修饰了的纤毛结合，从而恢复纤毛的介导能力，使特异性的噬菌体进入细胞体内增殖，这一系统显示了较高的筛选效率。

4 噬菌体肽库的应用

4.1 抗原表位的研究

传统的抗原表位分析主要是通过分析抗原经物理化学降解得到的片段或人工合成一系列来源于抗原的肽段与相关抗体的结合活性而得到，此方法成本高，必须首先确定蛋白质的氨基酸序列，才能合成相应的肽，而在实际研究中，许多蛋白质的序列并不清楚。噬菌体肽库技术将抗体作为受体暴露于肽库中，筛选到能与特异性抗体相结合的重组噬菌体肽的序列，弥补了合成肽筛选的不足。在抗原-抗体的识别研究中，不必源于天然抗原，可以从随机肽库中直接筛选出能和抗体结合的表位。尽管有时与天然表位在氨基酸顺序上可能不一致，但是它能模拟天然配体的结合特性，免疫动物后，可以诱导出与天然表位起交叉反应的抗体，竞争和抑制试验均表明能起到天然表位的作用。1984年建立的第1个肽库就是用来分析未知的抗原表位的[1]。该技术在肿瘤相关抗原表位的研究中也有重要作用。

4.2 免疫诊断研究

感染性疾病患者血清中含有针对抗原的各种抗体，但只有在天然抗原是微生物或者是已被克隆表达的情况下才容易获得纯抗原来鉴定特异性的抗体。而噬菌体随机肽库技术可以在某些天然抗原未知或天然抗原不容易获得的情况下，将特异性的重组噬菌体多肽作为抗原模拟肽用于临床疾病的免疫诊断。

在很多情况下，人们并不知道疾病的致病原，而且也很难得到病原体特异的单克隆抗体，因此可利用患者血清中所含特异性多克隆抗体来筛选噬菌体随机肽库，获得相应抗原表位，有可能进一步找到特异的诊断试剂。

4.3 基因疫苗研究

运用肽库的最大优点是不需要靶蛋白的任何结构，只需利用其抗体或受体来捕获噬菌体肽库中的小配体，并可大量繁殖，这为疫苗的设计、生产提供了极大方便。实验证明[10]，丝状噬菌体在多种动物系统中都具有良好的免疫原性，可作为载体与抗原模拟肽合成完全抗原，引起小鼠类似于天然抗原引起的免疫应答，产生的抗体能与天然抗原反应，通过检测免疫小鼠产生的抗体水平，从而筛选并确定噬菌体多肽作为疫苗。

4.4 药物筛选和开发研究

传统的新药开发，由于对蛋白质结构与功能关系不够了解，只能通过大规模的定点突变和费时的单个目的蛋白的克隆表达纯化与筛选来修饰现有蛋白。而噬菌体展示肽技术只要以一定功能的靶分子为受体，在天然蛋白质或特定功能的框架分子噬菌体展示文库中筛选配体，就可以简便快速地获得与靶分子具有强亲和力和特异性的小肽或新型蛋白，作为候选药物开发。目前该技术已广泛用于癌症、艾滋病、心血管病、组织器官移植、神经性疾病等领域药物的研究和开发，并已筛选出大量的受体拮抗物、酶抑制剂等。

5 展望

噬菌随机肽库日益受到人们的重视，噬菌体随机肽库技术也日趋成熟，并根据应用目的不同而构建了各种不同的肽库，其已成为探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲合力生物活性的配体分子、探测未知蛋白空间结构表位的工具，在蛋白分子相互识别的研究、新型疫苗的研制以及药物的开发等领域具有广泛的应用前景。

[1]Smith GR Filamentous Fusion Phage:Novel Expression Vectors That Display Cloned Antigenson the Virion Surface [J].Science，1985，228(26):1315-1317.

[2]丁淑燕，苗向阳，朱瑞良等.菌体表面展示技术.中国生物工程杂志.2003:28-31.

[3]McCarrey JR，Williams SA.Construction of eDNA Libraries from Limiting Amountsof Material[J].Cum Opin.BiotechnoL，1994，5(1):34-39.

[4]Medynski D.Phage Display:all Dressed up and Ready to Role[J].Bio-Technology，1994，12(9):1134-1138.

[5]Bass S，Greene R，Wells JA.Hormone Phage:an Enrich-ment Method for Variant Proteins with Altered Binding Properties [J].Proteins，1990，8(2):309-314.

[6]Mamyama IN，Maruyama HI，Brenner S.A 3.Phage Vectorforthe Expression ofForeign Proteins[J].Proc.Natl.Atari.Sci.USA，1994，91(40):8273-8277.

[7]邱兆华.基因治疗在血液病中应用进展[J].中国实用内科学杂志，2000，20(1):48-50.

[8]Skerra A，Dreher ML，Winter G.Filter Screening of Antibody Fab Fragments Secreted from Individual Bacterial Colonies:Specific Detection of Antigen Binding with a Twomembrane System[J].Anal Biochem，1991，196:151-155.

[9]舒新华，易新元，曾宪芳等.日本血吸虫病患者血清对噬菌体随机7肽库的免疫筛选[J].细胞与分子免疫学杂志，2000，16(2):109-112.

[10]俞海青，顾晓波.噬菌体展示肽技术及其应用.天津科技大学学报.2004(3):13-15.