重组高密度脂蛋白：治疗动脉粥样硬化及其他疾病的新靶点

墨菲

（昆明医学院第一附属医院糖尿病科 朱钊 编译宋滇平 审校）

引言

尽管医疗技术在不断进步，心血管疾病（CVD）仍然是全球患病率和死亡率最高的主要疾病，因此，新的治疗变革仍然是当务之急。目前CVD的治疗正在日趋完善——很大程度上归功于较好的预防风险管理和他汀类药物的使用，然而，多数不良心血管事件的发生仍不可避免。因此，需要一种新的治疗方法以管理CVD。

大量研究表明，HDL是CVD的逆向预测因子，且据推测，HDL有可能开发为一种心脏保护药物。进一步的研究也表明，HDL具有一系列心脏保护作用。其中包括逆向转运胆固醇(RCT)的能力、抗炎作用、抗血栓颗粒形成、刺激一氧化氮（NO）产生以调节血管张力。因此，大量证据表明，增加CVD患者循环中HDL可减轻疾病本身带来的负担。而HDL代谢途径的复杂多元性则为开拓一些有潜力提升HDL水平的方略敞开了路径。

HDL是一个极其复杂的颗粒，由多种脂质和蛋白质/酶组成，并且在粒子周期内不断地变化。HDL的组成成分也影响其大小、结构和功能。人为干预HDL合成通路可选择性地影响HDL的某一特定颗粒，从而可能选择性地作用于某些特定人群——他们可能无法承担HDL所有已知的保护心脏作用的全部费用。因此，提高HDL水平潜在有效的方法是静脉注射合成的HDL，一种HDL衍生物，被称作“重组HDL”（rHDL）。可以通过控制颗粒的大小和改变其组成来消除HDL变异。另一种可被考虑合成HDL的是apoA-I模拟肽——Sethi等人对其进行了详细地回顾。然而，本文关注的重点是apoA-I蛋白构成的颗粒。其重点是为rHDL治疗CVD 具有新的应用前景提供证据。我们将讨论多种rHDL颗粒、rHDL治疗目前的测试方法和将来可能的应用前景，包括其作为用药载体和诊断/治疗方面的潜力。

rHDL颗粒

血浆中循环的HDL特点以其主要蛋白质成分apoA-I决定。通过ABCA1介导或以被动方式吸收的方式，apoA-I和磷脂（PLs）相互作用，使一种被称作前β HDL的HDL增加。这种盘状HDL常由2个apoA-I分子缠绕1个PL中心组成，且rHDL模拟其形成。重要的是，rHDL的结构和组成是开放的，并且可以为特定的目的而设计，例如，采用特定的PLs装载apoA-I分子，可能具有比其他物质更强的抗炎效应。

除不同的PL外，不同的apoA-I分子也可使rHDL分子功能不同。其中包括天然产生的心脏保护物质apoA-IMilano和apoA-IParis，两者分别在残基173和残基151上精氨酸被半胱氨酸取代。野生型apoA-I不含任何半胱氨酸残基，故这种变异半胱氨酸是独一无二的。变异的同二聚体间以二硫键结合。然而，这似乎并没有影响其结合二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）或促进胆固醇代谢的能力。此外，异质性个体的两种变异物均可降低循环中HDL水平，而且，这些个体罹患动脉粥样硬化的风险也下降。随后，Nissen和同事们出色的研究证明，冠状动脉粥样硬化患者注射apoA-IMilano磷脂复合物（rHDLMilano）可有效减少其粥样斑块体积。另一种天然的apoA-I变异物似乎也具有心脏保护功能，其残基156上赖氨酸被缬氨酸取代（V156K）。已证明，V156K-rHDL具有较强的抗氧化和体内抗炎作用，而且，与野生型apoA-I相比，很少受髓过氧化物酶氧化，然而，与apoA - IMilano相比，其功能似乎并不强。

除了天然的apoA-I变异物外，蛋白质工程已开发生成了三聚体apoA-I复合物。通过将apoA- I融合到人类四连接素的三聚区域，Graversen和同事们开发出一种apoA-I变异物——与天然的apoA-I相比，其延长血浆保留时间（plasma retention）。此外，已证明，这种新型的三聚体apoA-I复合体具有生物学活性、可促进胆固醇代谢，与卵磷脂胆固醇酰基转移酶相互作用，延缓LDL受体缺陷(LDLr-/-)鼠动脉粥样硬化的发生发展。

动物研究

对小鼠和家兔的大量研究已明确地证明HDL具有抗炎作用。例如，与对照组相比，通过造apoA-I转基因小鼠动脉粥样硬化模型（apoE-/-和LDLr-/-）使apoA-I增加，结果发现，转基因组小鼠粥样斑块体积减少和血管张力改善。因此，采用rHDL治疗，提高易感动脉粥样硬化动物的HDL水平，是一个自然过程。

已证实，通过5周多的时间内18次注射rHDLMilano治疗小鼠（40mg/kg/次），rHDLMilano具有抗动脉粥样硬化作用。与基线水平相比，rHDLMilano可显著减少动脉粥样硬化、脂肪含量和巨噬细胞浸润，以及可显著促进胆固醇代谢。遗憾的是，研究中缺乏使用天然rHDL的研究队列，导致rHDL和rHDLMilano比较受限。然而，对两者进行研究显示，apoA-I变异物之间抑制动脉粥样硬化的程度一样，观察apoA-IMilano也未发现其具其他额外功能。对接受80mg/kg rHDLMilano单剂量注射的另一组小鼠的研究证明，斑块的发展可进一步减少。正如所建议的，单剂量注射rHDLMilano可重塑粥样硬化斑块——该结果令人鼓舞。后者的发现将导致进一步的研究，旨在探讨单一高剂量注射（400mg/kg）rHDLMilano对斑块组成的影响。注射48小时后，随着已染色的巨噬细胞的显著减少，斑块中脂肪含量明显降低。有趣的是，从这些动物研究得到的资料表明，高浓度单剂量rHDL注射可稳定动脉粥样硬化斑块。单剂量注射的进一步研究以及后期终点事件以确定rHDL有效性的维持时间，均将是极大的研究热点。然而，在rHDL治疗动脉粥样硬化安全性和有效性评价(ERASE) 实验中，由于反复使用80 mg/kg rHDL带来肝功能检查的异常导致了该试验的中止——这一结果令人震惊，故如此高剂量rHDL在人体的应用仍将具有较大的挑战。

已证明，ApoA-IMilano对SD大鼠的有利作用——降低总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和防止血小板聚集。此外，与对照组相比，可延缓化学诱导的血栓形成，且血栓重量明显减少。这些发现为apoA-I或 apoA-IMilano应用于恢复或稳定斑块奠定了基础。

已证实，rHDL对患血管炎的家兔有抗炎作用。Nicholls等人采用非闭塞性周围颈动脉诱导白细胞浸润到动脉壁——动脉粥样硬化斑块发展的早期过程。注射rHDL或apoA-I可抑制中性粒细胞浸润，以及促进VCAM-1和ICAM -1的表达。此外， PL囊泡可能通过重构内源性HDL和释放apoA-I分子以减少炎症反应。

人体研究

曾证实，健康人注射rHDL耐受性好，且可大大提高HDL和apoA-I水平。也证明，单剂量输注rHDL 25或40 mg/kg，4小时后循环中HDL分别升至大约30 mg/dl和50 mg/dl，超出基线水平。并且，至少在25小时内可明显增加。注射期间，前β HDL达高峰，且2小时内转变为α迁移HDL，观察6～10小时可发现前β迁移HDL达基线水平，这表明，通过注射这些颗粒（如：促进胆固醇排出）可快速转运胆固醇/脂类。

CVD的一个早期风险因素是高胆固醇血症，这与内皮功能失调有关。前臂血流量（FBF）的测量结果表明，高胆固醇血症患者对乙酰胆碱（ACh）的血管舒张反应减弱，而注射80 mg/kg的rHDL可逆转这一作用。注射rHDL也可改善2型糖尿病患者内皮功能障碍。在这两个研究中，rHDL使FBF恢复归功于NO的增加，因为NO抑制剂L-NMMA使FBF恢复到基础水平。体外研究曾证明，HDL通过激发一个信号级联反应导致内皮NO合成酶磷酸化，以刺激NO释放。

通过对rHDL在动脉粥样硬化动物模型的抗动脉粥样硬化作用的观察表明，rHDL使硬化斑块消退的作用是可以实现的，或至少可重塑斑块使其更稳定，这为扩展此实验到一些小型的人体试验中作出了良好的铺垫。关于急性冠脉综合征患者注射以apoA-IMilano为特征的rHDL复合物（ETC-216，辉瑞，英国）的效果，Nissen和同事们对此进行了研究。研究旨在通过血管内超声（IVUS）测量斑块负担（plaque burden）以明确其疗效。患者接受5周的安慰剂治疗，或15mg/kg、45mg/kg的ETC-216注射。以2周内急性冠脉事件作为IVUS基线水平，治疗后采用IVUS反复测量。研究发现，5周后，与基线水平相比，联合注射ETC-216组粥样斑块体积可减少4.2%。

2006年Nicholls和同事们实施了一个后续的临床研究，旨在明确在动物研究中粥样斑块消退和动脉壁重塑的关系，这为注射rHDL重塑血管壁提供了良好的证据。各治疗组得出的研究结果与2003年Nissen等人相同，且IVUS再次用于测量粥样斑块负担。另外，还比较了外部弹力膜（EEM）和血管管腔大小。与此同时，动脉粥样斑块体积减少，EEM减少4.6%，而管腔大小无影响。研究得出，注射ETC-216可使粥样硬化斑块逆转，且可重塑EEM，而管腔大小无变化。

最近，已研制开发了一种新型的rHDL（CSL-111，CSL研究组，澳大利亚）。ERASE试验研究了CSL-111对冠状动脉粥样硬化的作用，同样采用在rHDLMilano研究中的IVUS测量，患者接受4周的安慰剂（生理盐水），CSL-111 40 mg/kg 或80 mg/kg注射。遗憾的是，高剂量组由于肝功能检查异常试验被迫中止。CSL-111 40 mg/kg组和安慰剂组粥样斑块容积减少无统计学差异（-3.4% vs -1.6%），然而，与基线水平相比，前者减少更明显，达3.4%。关于注射HDL逆转粥样斑块的作用，本研究提供的证据较少，但较有利，然而，尚需长期的研究以评估这种临床治疗的有效性。必须承认，上述研究均采用IVUS（ETC-216或CSL-111）作为动脉粥样硬化的主要测量方法，未研究临床终点事件。人类注射rHDL是否给心血管事件带来有利结局，这点尚未明确，如果有，那么rHDL治疗有哪些具体的适应症。rHDL是否可诱导动脉粥样硬化斑块的逆转或阻止其发生发展，这点目前尚未明确。此外，任何IVUS研究中未检测到可溶性的炎症标志物，因此，粥样斑块体积与炎症潜在变化的相关性目前还未明了。

从最初对人类临床研究获得的资料表明，逆转粥样斑块的作用是显而易见的，而且重构也可能发生。此外，动物研究也表明，迅速增加HDL可影响粥样斑块的组成。我们致力于研究周围血管疾病（PVD）患者其粥样斑块是否会随着HDL水平迅速增加而趋于稳定型转化。随着斑块特征的变化，旨在明确注射rHDL后血浆炎症标志物与动脉粥样硬化相关的影响。对PVD组注射80 mg/kg的CSL-111 或安慰剂治疗7天后行旋切术，观察发现，注射rHDL组被激活的单核细胞显著减少，这与血浆中炎症标志物减少的趋势一致。且观察到斑块成分发生改变，包括脂肪含量减少、巨噬细胞浸润和VCAM-1阳性细胞产生。已证实，HDL和apoA-I 强有力地使单核细胞活化、黏附和体外迁移减少——这可能部分解释观察所发现的在切除的斑块中巨噬细胞浸润减少。因此，这表明，单一注射rHDL可迅速改变斑块组成——认为可形成更稳定的表型。然而，尚需大队列的随访研究以明确PVD患者斑块组成的改变是否可以反映CVD患者斑块的变化，尤其是，在治疗之前两者粥样斑块的组成可能不同——这些均具有极大的研究兴趣。确定rHDL对斑块的形成速度和维持时间很重要，尤其是据报告注射rHDL后不久apoA - I水平可恢复到基线水平。

关 于ETC-216（ 基 于apoA-IMilano） 和CSL-111（基于野生型apoA-I 的rHDL）的作用从未进行过头对头比较，荟萃分析也从未提供一个比另一个更好的证据。动物模型和体外研究均表明，与天然的apoA-I相比，apoA-IMilano不具有保护心脏功能的更大优势。

2型糖尿病患者的rHDL治疗

据前面所述，2型糖尿病患者HDL水平下降。因此，纠正HDL紊乱水平可获益。事实上，已证明，采用rHDL不仅具有心脏保护作用，而且可以改善2型糖尿病患者的新陈代谢功能。Drew等人最近的文章指出，HDL可以调节2型糖尿病患者的糖代谢。在长达4小时的注射时间内，单一高剂量注射rHDL可显著降低血糖水平。随着血浆胰岛素水平显著增加，血浆葡萄糖水平减少。据报告，当采用稳态模型函数测量β细胞时，β细胞功能改善。据推测，注射rHDL30分钟后血糖水平下降，这可能是由于rHDL激活骨骼肌AMPK系统，直到注射到2.5小时血浆胰岛素水平才开始上升。基于体外研究资料发现，β细胞功能改善与胰岛素水平增加有关，这似乎是rHDL对β细胞的直接作用。

Drew和他的同事们还研究了2型糖尿病患者注射rHDL的抗炎作用。注射rHDL 0、4和72小时后提纯血浆中HDL，评估HDL颗粒对人冠状动脉内皮细胞ICAM-1和VCAM-1体外表达的抑制能力，发现rHDL可增强血浆中HDL的抗炎作用。与既往报道一样，本研究中糖尿病患者分离出的HDL水平紊乱，且未能显著抑制ICAM-1和VCAM-1的表达。注射rHDL后分离出的HDL可显著减少这些粘附分子的表达，且72小时后作用仍明显。ICAM-1和VCAM-1与血浆中HDL水平相关。评估血浆中分离出的胆固醇发现，与安慰剂组相比，注射rHDL组显著改善。McGillicuddy等人最近的研究揭示，炎症反应可抑制体内胆固醇逆向转运（RCT），资料同时显示，HDL可显著减轻整体炎症反应。事实上，正如从接受安慰剂或rHDL治疗者血浆中正常供体分离培养出的中性粒细胞的情况来看，注射rHDL可显著减少粘附。此外，单核细胞体外激活的试验结果表明，与安慰剂相比，注射rHDL可显著减少单核细胞活化。测量可溶性的ICAM-1和VCAM-1水平，sVCAM-1水平减少，血清sICAM-1则无改变。另一项关于2型糖尿病患者的研究表明，rHDL可增加循环内皮祖细胞数量。有趣的是，仅在注射7天后明显，这表明注射rHDL也可延缓和维持该作用，这与对PVD患者的研究一致。因此，一个重要的问题是，需要随访以确定rHDL治疗是否能纠正血脂紊乱以达到正常水平，从而允许在人体应用并以此与疾病作斗争。如果是，单一注射可能会比预期的获益更多。

基于rHDL的治疗：新的适应症

关节炎

HDL主要是针对心血管有关疾病的治疗，其他用途正在研究中。正如前面所述，HDL一个明确的作用是抗炎。已证明，HDL颗粒可改变类风湿性关节炎患者的促炎分子。阿托伐他汀的治疗似乎可促进HDL颗粒的抗炎效应，同时C反应蛋白水平下降，但是，观察发现，临床症状未得到改善。采用胶原诱导的类风湿关节炎动物模型的研究证明，使用D-4F模拟多肽和普伐他汀可改善HDL抗炎指数。HDL的改善作用与积极的临床结局呈正相关。此外，治疗后血清炎症分子减弱——扩大到T细胞/单核细胞体外联合培养的研究发现，其中，除普伐他汀外，D-4F大大减少接触介导的T细胞激活和随之而来的一系列细胞因子的释放。D-4F是一个模拟多肽，而不是rHDL颗粒，然而，可据它发现和推断HDL治疗可能获益。同样，正如Remaley等所述，rHDL取得的研究成果可能过渡到apoA-I模仿肽。

记忆力减退

大脑中脂蛋白代谢呈动态状态，神经元需要迅速转换脂质，故RCT在大脑也很活跃。低水平的HDL和apoA-I与短期记忆力减退和阿尔茨海默病(AD)的发生有关。此外，apoA-I基因的多态性影响非家族性AD的早期发生风险。Whitehall II研究中，5年随访观察中年试验者短期口头记忆能力。结果表明，短期口头记忆力下降与血浆中HDL减少有关。HDL本身不能穿过血脑屏障，apoA-I也不能在中枢神经系统产生。已经证明，apoA-I从血浆透过血脑屏障进入中枢神经系统，形成HDL颗粒，这些HDL颗粒在apo E中含量也很丰富。HDL保护神经的潜在作用机制很多。HDL对突触的成熟和维持突触的可塑性至关重要。HDL可抑制淀粉样蛋白β（Aβ）的产生，且可结合过多的Aβ，而Aβ具神经毒性导致记忆力受损。HDL是一种强有力的抗炎分子，也认为，其可减少星形胶质细胞的炎症反应。然而，增加HDL水平或其受体数量可保护记忆力，或对AD产生直接影响——这两点均尚未明确。此外，由于仅apoA -I能穿过血脑屏障，故其载体模式也极具挑战。

药物载体

除抗动脉粥样硬化作用外，HDL可被用于输送靶向药物的载体。已证明，在大鼠中静脉注射携带诺西肽（一种抗乙型肝炎病毒的分子）的rHDL颗粒，30分钟内大多数抗乙型肝炎病毒分子可到达肝脏。同时也检测到HDL是抗癌药物的载体。将带有HDL颗粒的抗癌药物紫杉醇应用于小鼠身上发现，其耐受性优于游离药物。HDL可作为药物载体，然而，该作用的可行性尚需进一步研究。

诊断与治疗

HDL也被用于磁共振成像（MRI）造影剂的载体，如作为用于血管成像的钆的载体。具抗动脉粥样硬化特异性的rHDL颗粒采用的是apoE基因衍生肽P2fA2，且作为钆的载体。已证明，在体外，HDL P2fA2颗粒被巨噬细胞吞噬。对apoE-/-基因鼠再次注射rHDL P2fA2观察发现，主动脉动脉粥样硬化斑块区巨噬细胞特异性颗粒聚集，而正常区域无表达信号。对于体内比较脆弱的斑块，成像可能是一个有价值的检查方法，因为巨噬细胞浸润与斑块的严重程度呈正相关。令人关注的是，明确这些rHDL颗粒是否仍有抗动脉粥样硬化的作用，如果他们有多种用途，则可能会使其更具吸引力。

rHDL治疗的优点和缺点

关于rHDL对人体抗动脉粥样硬化潜力的研究，已证明其治疗心血管及相关疾病所具有的多重优势。已表明，PVD患者使用rHDL可稳定动脉粥样硬化斑块。rHDL对于其他血管的作用具有更大的研究兴趣。然而，已有一些证据表明，使用IVUS 可发现rHDL可重塑冠状动脉斑块，但尚未明确rHDL改变冠状动脉斑块组成的程度。对2型糖尿病患者注射单一高剂量HDL，可调节胰岛素分泌水平和葡萄糖摄取能力，这一证据开辟了rHDL治疗的新途径。因此，增加2型糖尿病患者HDL水平，这一长期作用的研究结果令人期待。

迄今为止，仅检测了小部分急性使用rHDL人群，整体上rHDL治疗是有效的。然而，仍缺乏足够的证据以明确rHDL治疗对预防心血管事件可获益。显然，这类有效的研究尚需大量多中心临床试验。rHDL治疗的主要缺点是大量rHDL生产的成本费用和一些实际问题，以及与口服药物相比注射HDL治疗的时间相关问题。作为一种慢性病药物的使用，可能会比较复杂，且其应用也会受限。与安慰剂组相比，人体反复注射不会增加任何不良事件。此外，rHDL似乎耐受性好，不会引起免疫反应。此外，因为apoA-I是从人血浆中纯化，一旦用于临床输注，所有筛查血样的方法都要进行。至于针对rHDL颗粒的免疫反应观察，目前尚无长期研究。

如果rHDL治疗的确可以导致斑块消退，将有必要明确这种疗法是否比手术更可取。与采用HDL通路抑制剂（如胆固醇酯转运蛋白）治疗相比，rHDL治疗的明显优势在于，它是一种直接增加已知HDL水平的途径。显而易见的是，rHDL在临床中迅速稳定斑块的作用很强大，可用于术前或术后护理以最大限度地减少斑块破裂引起心肌梗死或卒中的风险。

应用前景

迄今为止，有限的研究表明，rHDL的临床应用前景似乎相当广阔。研究发现，HDL不仅对CVD具保护作用，对关节炎等其他炎症性疾病也具积极效应。然而，考虑到rHDL在临床的常规应用，仍需大量的研究证明rHDL治疗确实可行。其保护心脏的作用机理，以及是否需要联用以发挥最大的保护作用等均需进一步了解。rHDL已明确的临床应用是治疗CVD，但尚未明确哪类人群使用rHDL将会获益（例如：需稳定斑块的急性冠状动脉综合征患者或是更广泛的患病人群）。

HDL的作用似乎是稳定斑块，减少已报告的影响动脉粥样硬化的循环细胞的炎症状态，这表明，它可以用于术前或术后治疗以尽量减少血管外科手术的风险。据此推断，基于rHDL的治疗具有潜在而广阔的临床应用前景，将成功地推进CVD的管理。