国内绵羊高繁殖力基因的研究和应用

王 旭,买买提伊明◦巴拉提

(新疆农业大学动物科学学院,乌鲁木齐 830052)

绵羊多为季节性发情和一胎单羔,在世界绵羊品种库的近700个绵羊品种中只有少数具有产羔数多、性成熟早和常年发情的特点,因此高繁殖力的绵羊具有广阔的发展前景。

产羔数常作为衡量绵羊繁殖力的重要指标,但因绵羊产羔性状的遗传力很低(0.03～0.1),所以单纯的表观选择很难提高这一性状,同时多胎性状受基因优劣、年龄大小、季节变化和营养状况等内外因素的影响,其中基因是影响绵羊多胎性状的一个最主要的因素,因此通过对绵羊多胎主效基因的研究可为绵羊的辅助育种提供素材,并可建立迅速提高绵羊产羔性能的育种方法。

1 常见的高繁殖力基因

1.1 FecB基因

FecB基因最早是在Booroola绵羊上发现的,也是目前研究最为成熟的控制绵羊高繁殖力的主效基因,该基因于1989年由绵山羊遗传命名委员会正式命名。Piper等[1-2]研究发现该基因是由常染色体上控制繁殖性状的基因发生突变所致,具有提高排卵数和产羔数等生物学作用；一个拷贝的FecB基因平均可增加排卵数1.65个,增加产羔数0.9～1.2只；两个拷贝平均增加排卵数2.7～3.0个,增加产羔数1.1～1.7只。

Wilson等[3]、Souza等[4]和 Mulsant等[5]几乎同时发现FecB基因所在的绵羊6号染色体区域同线性的人4号染色体q22～q23上的骨形态发生蛋白受体IB基因(bone morphogenetic protein-IB gene,BMPRIB)与Booroola绵羊的排卵率存在关联。BMPR-IB基因调节生长和分化的多功能蛋白,所在区域含有FecB位点,该基因编码序列长1 509 bp,由10个外显子组成,编码502个氨基酸。Souza等[4]的研究发现BMPR-IB的激酶区域有2个点突变,其中1个突变为编码区746碱基(A→G)的突变,该点突变使非突变型的谷氨酰胺变成Booroola羊的精氨酸(Q249R),并证明Q249R就是FecB基因等位基因；之后的研究便把BMPR-IB基因作为高繁殖力基因FecB基因的候选基因。

王根林等[6]利用“forced”限制性酶切片段长度多态性PCR技术首次发现湖羊和小尾寒羊存在FecB基因,基于这两绵羊品种产羔率高,分别为228.92%和270%,所以认为FecB基因是控制它们多胎性状的重要基因。王启贵等[7]以绵羊BMPR-IB基因为候选基因,检测湖羊、中国美利奴羊单胎和多胎品系中该基因的多态性,结果在不同品系羊中产生3种基因型(BB、B+和++),湖羊以BB基因型为主,中国美利奴羊单胎品系以++基因型为主,多胎品系以B+基因型为主；BB和B+基因型的母羊产羔数明显较++基因型的母羊多。BMPR-IB基因在绵羊各品系间的分布和不同基因型绵羊的实际产羔情况表明：BMPR-IB为影响绵羊的产羔数的主效基因,可以用于对绵羊产羔数的选择。其他学者[8-12]的研究均发现小尾寒羊、湖羊和中国美利奴羊多胎品系存在Q249R(A746G)突变,并且小尾寒羊以BB型基因为主,湖羊几乎全为BB型基因,中国美利奴羊多胎品系以B+基因型为主,B基因与这3个绵羊品种的产羔数呈正相关,也认为BMPR-IB基因是控制这些绵羊高繁殖力的主效基因。

管峰等[13]的研究发现湖羊全部为BMPR-IB基因的突变纯合体(BB),但并不认为该基因是控制湖羊多胎性能的主效基因；经选育后湖羊的产羔率显著提高,说明BMPR-IB基因突变并不是影响湖羊品种内产羔率差异的主要因素,湖羊产羔率的差异还可能受其它因素或基因的影响,因此湖羊多胎性状的分子机制还需进一步研究。

钟发刚等[14]对中国美利奴羊多胎品系(新疆型)绵羊群体中BMPR-IB基因多态性分布与情期排卵数的研究发现,该群体中BB、B+基因型的情期排卵数平均为4.0个和3.5个,中国美利奴羊单胎群体母羊情期排卵数平均为1.56个,BB、B+基因型比++基因型的母羊分别多排卵2.44个(P＜0.01)和1.94个(P＜0.01),表明该基因具有明显增加排卵数的作用,进一步确定BMPR-IB基因是影响中国美利奴羊多胎品系高产的主效基因,可以用于产羔数的标记选择。但陈勇等[15]研究发现中国美利奴羊(新疆型)多胎品系的B+基因型与++基因型母羊的平均窝产羔数并无显著差异,并认为B等位基因与中国美利奴羊(新疆型)多胎品系的多胎性无关,BMPR-IB基因分析方法不宜用于该品系多羔羊群的选育。

陈晓军等[16]、史洪才等[17]和钟发刚等[18]以多浪羊为研究对象均发现其存在BMPR-IB基因(A746G)的突变个体,但以++基因型为主,B+基因型的频率分别为0.050 8、0.350和0.039；柳广斌[19]首次在多浪羊中检测到突变纯合子,B+基因型的频率为0.167。陈晓军、史洪才和柳广斌认为多浪羊的多胎性能与BMPR-IB基因存在极为密切的遗传连锁关系,很可能与Booroola羊遗传机制相同；但钟发刚认为多浪羊并非是一个多胎绵羊品种,其高产性能主要是由于该品种四季发情,而出现一年四季产羔。

1.2 FecX基因

Davis等[20]在多胎品种 Romney羊的 Inverdale和Hanna家系中X染色体上分别发现存在突变位点FecXI和FecXH,用携带FecXI基因的公羊(IY)与杂合子母羊(I+)交配,获得纯合子个体(II),结果II个体出现条斑卵巢且不育。Inverdale和Hanna是2个独立的家系,但将 FecXI和 FecXH杂交得到的FecXIFecXH羊表现出与FecXIFecXI羊相同的表型特征,即具有条斑卵巢且不育[21]。骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)是转化生长因子β的超家族成员,在卵巢中特异性表达已定位在人X染色体Xq11.2上,FecXI和FecXH携带者的BMP15均发现有突变,但BMP15与FecX位点之间无重组现象,故BMP15可作为FecX位点的候选基因。

FecXH携带者的BMP15编码区的第67个碱基由C突变成T,使第23个氨基酸残基处的谷氨酸变成终止密码子,编码肽链提前终止,导致FecXH纯合子个体的BMP15完全失去生物学功能；FecXI携带者在第92个碱基处发生突变(T→A),导致在高度保守蛋白质区内的第31个氨基酸残基由缬氨酸替换成天冬氨酸,阻断了BMP15形成二聚体,从而使FecXI纯合子母羊的BMP15的生物活性受到干扰而使FecX纯合子表现为不育；FecX杂合子母羊的BMP15基因中有一个拷贝失活,导致腔卵泡中的颗粒细胞对LH浓度的敏感性增强,从而增加排卵率[22]。

Hanrahan等[23]研究BMP15基因对Belclare绵羊和Cambridge绵羊高繁殖力影响时,发现 BMP15基因编码区718处碱基突变(C→T)使肽链编码区239位氨基酸由谷氨酰胺变成了终止子,即FecXG突变又称B2突变,该突变可能导致了BMP15功能彻底丧失；Belclare绵羊的BMP15基因编码区1 100处的碱基突变(G→T),导致了编码区367号氨基酸残基丝氨酸改变为异亮氨酸,即FecXB突变又称B4突变,对绵羊高繁殖力影响显著；BMP15基因核苷酸28～30位的碱基CT T缺失,导致编码区10号氨基酸残基亮氨酸缺失,形成B1突变体,该突变没有改变BMP15的功能；BMP15基因核苷酸747位的碱基T突变为C,未引起249号氨基酸残基脯氨酸的改变,形成B3突变体,该突变也没有改变BMP15的功能。Belclare绵羊的B2突变纯合子和B4突变纯合子都是不育的,B2和B4两者同时突变形成的杂合子(B2B4)也是不育的；Cambridge绵羊的B2突变纯合子也是不育的；当BMP15基因突变为杂合子时,Belclare绵羊和Cambridge绵羊排卵数都增加。

柳淑芳等[8]、管峰等[13]和王启贵等[24]分别研究小尾寒羊、湖羊和中国美利奴羊多胎品系群体中BMP15基因的FecXI和FecXH突变位点,结果都没有在相应绵羊群体中发现这两个突变位点存在多态性,从而排除了这两个突变影响排卵数的可能性。白杰等[25]和柳广斌[19]检测多浪羊BMP15基因的FecXI、FecXH、FecXG和 FecXB四个突变位点,结果也没有检测到相应的突变,推测其多胎机制与BMP15基因无关。

杨晶等[26]根据绵羊BMP15基因全序列设计6对引物覆盖全部的外显子,结果只有1对引物在小尾寒羊上具有多态性,测序结果表明：AB基因型和AA基因型相比在cDNA第28 bp处缺失了3个碱基(CT T)也即是B1突变,平均产羔数多0.20只,差异不显著(P＞0.05),说明BMP15基因的B1突变对其高繁殖力没有显著影响。储明星等[27]发现湖羊和小尾寒羊中都没有BMP15基因的B4突变(G→T),湖羊中也没有B2突变(C→T),但在小尾寒羊BMP15基因编码序列第718位碱基处发生了B2突变,同时存在突变杂合基因型(AB)和野生纯合基因型(AA)两种基因型,且AB基因型比AA基因型平均产羔数多0.62只(P＜0.01),说明BMP15 B2突变对小尾寒羊高繁殖力的影响十分显著。

1.3 FecGH基因

FecGH突变又称 G8突变,是生长分化因子 9(grow th differentiation factor 9,GDF9)基因编码区第2外显子1 184bp处发生C→T转换后,使成熟肽链第77位氨基酸发生丝氨酸到苯丙氨酸的转换,该基因是位于5号染色体上的常染色体基因[28],对早期卵泡的生长和分化起到重要调节作用。Hanrahan等[23]研究发现Belclare绵羊和Cambridge绵羊除BMP15突变外还存在一个GDF9突变,并且2种突变表型相似,杂合母羊排卵率增加,纯合母羊卵母细胞可发育到正常大小,但卵巢表面呈“斑纹”状,上皮颗粒脱落,有丝分裂不能完成,并且卵泡周围的颗粒细胞表现异常状态,最终导致不育。

以GDF9基因为高繁殖力候选基因,柳广斌[19]和白杰等[25]对多浪羊以及储明星等[27]对小尾寒羊和湖羊进行相关研究,结果均没有检测到GDF9基因的G8(C→T)突变；排除了GDF9基因突变影响多浪羊、小尾寒羊和湖羊高繁殖力的可能性。

李碧侠等[29]根据绵羊GDF9基因全序列,在外显子1和外显子2处各设计1对引物,分析其在小尾寒羊、湖羊、陶赛特羊和萨福克羊4个绵羊品种的多态性。引物1存在3种基因型即AA、AB和BB,小尾寒羊只有AA基因型,湖羊和多赛特羊有AA和AB两种基因型,只有萨福克羊存在3种基因型；测序结果显示BB型与AA型相比在cDNA第152处发生了单碱基的改变(A→G),并导致了氨基酸的改变(天冬酰胺→天冬氨酸)。引物2只有AA和AB两种基因型,小尾寒羊只有AA基因型,其它品种均有两种基因型。对两对引物扩增片段的多态性分析发现：高繁殖力的小尾寒羊和湖羊的AB基因型频率明显低于低繁殖力的萨福克羊和陶赛特羊AB基因型频率,可能AB型与绵羊高繁殖力存在一定的负相关。

2 高繁殖力基因的利用

2.1 用于群体的提纯

随着高繁殖力候选基因的确定和分子生物技术在遗传学上的应用,使得品种的提纯进程大大加快。目前的研究大多认为FecB基因是控制小尾寒羊和湖羊高繁殖力的主效基因,据此储明星[30]提出对小尾寒羊和湖羊FecB基因进行检测,将基因纯合的BB型母羊和公羊集中在一起,这样扩繁产生的后代全部是BB型小尾寒羊和湖羊,从而建立小尾寒羊和湖羊超高繁殖力核心群,为培育超高繁殖力绵羊新品种提供物质基础。

FecB基因是由于常染色体上的正常基因突变而引起的,在我国的一些地方品种中也发现该突变。如新疆的多浪羊,已被证明[16-17,19]该突变可能是控制其多胎的主效基因,只是B基因频率较低,因此可以通过检测FecB基因,再采用同质选配,逐步提高群体中B基因频率,进而把多胎性能主效基因固定下来；从而使地方品种固有的优良特性在得到保护的情况下建立高繁殖力的核心群。

2.2 用于杂交改良,培育新多胎品系

由于绵羊繁殖性状为低遗传力(0.10左右)性状,常规遗传改良耗时较长,进展太慢,阻碍了我国绵羊生产能力提高的进程。从遗传育种角度来看,最经济有效的方法是利用控制多胎性能的主效基因,或利用与控制多胎性能的数量性状(QTL)相连锁的标记进行辅助选择或导入以提高绵羊的平均产羔数。因此,引进多胎品种改良本地绵羊再对其杂种后代进行横交固定和扩繁,可培育新的多胎品系。

紫泥泉种羊场[31]1981年挑选具备中国美利奴羊(军垦型A品系)品种特征、本身双羔以上或连产双羔以上个体组成基础群,导入湖羊血液；然后采用回交,再采用适当的近交手段固定多胎性状,经多年选育形成了具有高繁殖力、高泌乳量和优良羊毛品质等优点的中国美利奴羊(新疆军垦型)多胎品系。巩乃斯种羊场从1988年开始在新疆畜牧科学院的专家指导下,引入湖羊公羊同中国美利奴羊(新疆型)二、三级母羊进行杂交试验,也培育出了多胎类型细毛羊。

2.3 用于经济杂交

随着羊肉特别是羔羊肉需求的增加,利用多胎绵羊开展经济杂交生产肉羊和羔羊显得尤为重要。经济杂交一般采用三元杂交或双杂交模式,首先是利用高繁殖力绵羊(如Booroola、小尾寒羊和湖羊等)与其它品种杂交,获得含FecB基因的杂种母羊(产羔率高、性成熟早、泌乳力强),再用生长速度快的终端父本杂交生产肥羔。刘金祥等[32]采用无角陶赛特、小尾寒羊和滩羊进行三元杂交,结果表明：无角陶赛特羊×小尾寒羊×滩羊三元杂交羔羊的初生重、繁殖成活率、6月龄体重分别比小尾寒羊×滩羊二元杂交羔羊提高12.58%、10.73%、28.58%；既发挥了当地滩羊耐粗饲、适应当地自然气候条件的特点,同时小尾寒羊多胎率及四季发情的特点也得到体现,又改进了二元杂交羔羊体躯不丰满和产肉量低的缺陷。王元兴等[33]以国外优良的肉用公羊为父本,湖羊为母本进行杂交,其产羔率达231.68%,与湖羊纯繁产羔率251.25%相比差异不明显(P＞0.05),杂交一代母羊的产羔率为181.82%,与外种羊纯繁的产羔率158.33%相比有所提高,但相对于湖羊的产羔率有明显下降,并认为产羔率主要取决于母羊的排卵数。湖羊在当地能耐最高气温37～39℃,全年相对湿度80%左右,这是其它绵羊所不及的。因此湖羊适于南方各省饲养,是推广肉羊生产特别是利用杂种优势生产肥羔的优良品种。

2.4 用于杂交后代繁殖力的评定

高繁殖力候选基因不但可以用于多胎品种的提纯,而且可用于对杂交后代繁殖力的评定。于佐卿等[34]以绵羊GDF9和FecB基因为候选基因,研究德滩寒杂种羊和陶滩寒杂种羊(均含有小尾寒羊血液)的基因多态性及其对产羔数的影响,结果表明两种基因在两种杂交绵羊群体中各有2种基因型,分析发现GDF9基因的杂合子与两种杂种绵羊的产羔数之间呈显著负相关；FecB基因杂合子与陶滩寒杂种羊产羔数之间呈显著正相关。

王公金等[35]选择BMPR-IB作为侯选基因,研究该基因在杜泊绵羊、湖羊、小尾寒羊及杜湖、杜寒杂交F1代群体中的多态性分布规律。结果发现：小尾寒羊和湖羊普遍存在2种基因型BB和B+,而杜泊绵羊只有1种基因型++,杜寒杂交和杜湖杂交后代的基因型为BB和B+,并且杂交后代的基因型频率与杜泊绵羊的基因型频率差异极显著(P＜0.01),可以看出杜泊绵羊与多胎绵羊品种湖羊和小尾寒羊杂交后代羊群繁殖性能的遗传性状得到了有效改善,因此BMPRIB分子标记可作为一种新颖的辅助技术用于评估杜泊绵羊与湖羊或小尾寒羊杂交后代的繁殖力。

对于一些含有FecB基因突变但基因频率比较低的绵羊,或是对FecB基因是否为其多胎主效基因不确定时,可用该品种与繁殖率低(只有++基因型)绵羊杂交,测定含有FecB基因的F1代的繁殖力,如果F1代多胎性状明显,则可以确定FecB基因为该品种的多胎主效基因。对杂交后代繁殖力的测定既可用于该品种的提纯也可用于杂交后代表观繁殖性能等性状的鉴定与比较,淘汰杂交后代中野生基因型个体,选择突变基因型个体进行世代横交固定,以便培育出高繁殖性能的肉用绵羊新品种(系)。

3 展望

目前国内的研究大多是检测某个品种或品系有没有相应已检测出的多胎基因,对多胎基因验证研究做的不多,于是在一些问题上存在着分歧,如：管峰等[13]认为BMPR-IB基因突变并不是影响湖羊品种内产羔率差异的主要因素；陈勇等[15]认为BMPR-IB的B等位基因与中国美利奴羊(新疆型)多胎品系的多胎性无关,BMPR-IB基因分析方法不宜用于该品系多羔羊群的选育；钟发刚等[18]认为多浪羊并非是一个多胎绵羊品种。因此对已检测出的多胎基因有必要进行验证,比如通过测定高繁殖力绵羊与低繁殖力绵羊的杂交后代的繁殖力,看其含有多胎基因(如FecB基因)的F1代繁殖力的高低,进而确定这些品种的BMPRIB基因是否为其主效基因,也可以研究多胎基因的遗传情况以及在不同世代中的传递规律；同时测定多胎绵羊的其它候选基因,看这些基因之间是否具有协同效应。

世界上生产性能比较高的绵羊品种,基本上都不是单一血统,大多是通过杂交再经过长期的选择和培育而形成的。因此通过对具有高繁殖力性能绵羊的研究,有目的的利用杂交手段,对杂交后代进行选育和横交固定可培育出新的品种或品系；也可以利用高繁殖力绵羊品种与低繁殖力绵羊品种之间的杂交,以提高杂交后代的生产性能进而增加养殖绵羊的经济效益；但同时也要注意保护地方品种的优良特性。

另外多胎羔羊适合于舍饲,粗放的放牧形式使得母羊的产奶量不高,再加上环境等因素的影响则不利于羔羊的成活。因此在选用不同多胎品种进行杂交的时候,需要结合当地的情况,考虑到气候条件、生产力状况和饲养水平等以便选择用于杂交的绵羊所产生的后代能够较好的适应当地的情况。

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