影响动物克隆效率因素的研究进展

李亮亮,杜 珊,刘 军,赵晓鹅,马保华

(西北农林科技大学动物医学院,陕西 杨凌 712100)

克隆,即无性繁殖,是通过无性形式由单个细胞产生和亲代非常相像的单个动物后代。这里所说的单个细胞从来源上既可以是体细胞,也可以是胚胎细胞；从年龄上看,既可以是成年细胞,也可以是幼年或胎儿细胞。在高等哺乳动物中,细胞核移植技术是生产克隆动物最为有效的克隆技术,因此,动物克隆技术实际上是指细胞核移植技术。

哺乳动物细胞克隆是20世纪末生命科学领域最引人注目的高新技术,已经在畜牧业生产、医药生产和疾病治疗、生物学基础理论研究、野生珍贵濒危动物的保护以及转基因工程等诸多领域蕴藏巨大的潜力。通过科学研究者近十年的努力,哺乳动物的克隆技术在农业和生物制药等方面取得了划时代的进步,展示了克隆技术的巨大应用价值和广阔的发展前景。

自1997年首次获得体细胞克隆绵羊[1]以来,已经有牛[2]、小鼠[3]、山羊[4]、猪[5]、兔[6]、猫[7]、骡子[8]、马[9]、大鼠[10]、狗[11]等多种克隆动物相继问世,虽然动物克隆已经在多种动物上取得成功,但是克隆技术目前仍存在一些问题,如效率低、出生的动物存在生理缺陷等多方面的问题,积极寻求问题的解决方法是关键所在。

哺乳动物体细胞核移植技术形成了一套比较完善的程序,主要包括：核受体胞质的准备、核供体细胞的选择和处理、重构胚的构建、重构胚激活、重构胚的培养等。

1 供体细胞因素

1.1 供体细胞的类型

自1997年Wilmut I等利用成年绵羊乳腺细胞克隆出绵羊“多莉”以来,人们已分别利用不同的细胞克隆出山羊、猪、猫、兔、骡、马、大鼠和狗等哺乳动物。但是,不同的细胞类型,对克隆的成功率影响很大。

Kato Y等[12]比较了牛同一个体卵母细胞和输卵管细胞及不同个体体细胞：肝细胞、耳细胞、子宫细胞、表皮细胞、输卵管细胞及卵母细胞对克隆效果的影响,结果认为牛的卵丘/颗粒细胞和输卵管细胞最适合用于牛的核移植。杨素芳等[13]在水牛研究中采用成体成纤维细胞、胎儿成纤维细胞、胎儿皮肤细胞和卵巢颗粒细胞作为供体细胞来源用于核移植。结果显示,来源于卵丘/颗粒细胞的重构胚,其融合率、卵裂率和囊胚发育率都高于其他3类细胞。卵丘/颗粒细胞适合作为供体细胞的可能原因：①卵丘细胞是自然静止在G0/G1期的细胞；②卵丘细胞是包围在卵母细胞周围的细胞,核移植后两者胞质更易互融；③卵丘细胞内端粒酶活性较高。染色体端粒的长度在核移植胚胎的发育中可恢复到正常水平[14]。并且,卵丘细胞与卵母细胞在激素水平上趋于一致,所处组织环境与子宫内环境相似,利于重构胚的发育生长。

1.2 供体细胞周期

细胞周期对核移植成功率的影响至关重要。“多莉”诞生以后,其研究者认为[1],成功的关键因素之一是供体细胞经血清饥饿后,处于G0期,认为这种细胞易于重编程。但是,细胞同步化处理是否是克隆成功的必要条件,并无定论。Cibelli J B等[15]利用非静止期细胞克隆出了转基因牛。因此认为,处于分裂状态的细胞群通过核移植仍具有支持分化细胞发育到正常个体的能力。Beyhan Z等[16]认为,长时间低血清浓度处理可能破坏核细胞内DNA结构,影响移植成功率。目前,由于S期细胞处于DNA合成阶段,重构胚易形成2倍化和4倍化之间的非整倍体动物,而没有克隆个体的报道以外,其他G1、G2和M 期[17]的细胞都被证明可作为供体,用于克隆研究。

1.3 细胞传代次数

细胞的传代是否利于克隆个体方面的说法不一。但是大多数研究者使用的是原代培养或短期培养的细胞,认为这类细胞利于核移植胚的发育。但 Kasinathan等[18]利用传至18代细胞用于核移植,结果并未影响移植胚的发育潜能。Arat S等[19]的研究认为,传代培养15代的细胞核移植后,囊胚率高于培养10、11、13代的细胞。说明培养代数高的细胞比代数低的细胞克隆效率高。究竟是什么机制控制这种高传代数高移植效率的发育呢?目前尚无定论。可能是细胞在传代过程中,一些老化细胞,如染色体破坏严重,DNA结构受损的细胞被淘汰。剩余的细胞具有比较完整的核酸结构,对外部环境有较强适应性的细胞保留下来,同时能适应核移植过程中的一些机械损伤,最后与卵母细胞融合并发育成克隆个体。

2 受体细胞的因素

迄今已有3类受体细胞用于核移植培育了后代 ,第1类是去除原核的合子 ,但仅局限于用原核或假原核作为供体。第2类是早期胚胎 ,但也只适合于用具有全能性的卵裂球作为供体。第3类是卵母细胞,也是哺乳动物核移植使用最多的一类受体,这类受体接受各阶段胚胎的卵裂球,早期胎儿细胞、体细胞或胚胎干细胞均获得了后代。

受体细胞的去核是核移植中关键环节,去核不完全将导致重构胚的染色体倍性异常,进而导致胚胎发育异常。此外去核过程还会给卵母细胞带来不同程度的物理和化学损害,因此不断优化去核方法和选择适合于不同动物的去核方法有助于提高克隆动物的效率。目前,应用比较广泛的去核方法有盲吸去核法和化学诱导去核法。

2.1 盲吸去核法

通常,盲吸法去核的时间选择在第一极体刚排出时,因随时间延长卵细胞核远离第一极体,影响去核效率。严兴荣报道[20],注射hCG 10 h后去小鼠卵核,去核率达90%以上；而12 h后去核,去核率下降22%。不同动物的最佳去核时间不同,牛卵母细胞一般为体外成熟18～20 h后,而猪卵母细胞则在体外成熟44～48 h后为宜。此外,不同动物卵母细胞的结构特点不同,其盲吸法的去核效率也不同。崔奎青[21]利用兔卵母细胞在相差显微镜下观察到染色体的特点,将盲吸法与spingdle view系统结合,去核率达98.4%,且损失的胞质少；因小鼠卵母细胞抗机械损伤能力差,去核后卵母细胞成活率低,小鼠卵母细胞法借助Piez系统,去核率高达99%,且成活率也达95%,这种方法对那些抗损伤能力差的动物卵母细胞不失为一种有效的替代盲吸法的机械去核法。

盲吸去核法虽然存在这样一些不足,但其操作简捷、迅速,仍是目前哺乳动物克隆普遍采用的方法。该法的不足在于造成胞质流失和一些重要因子的丢失,从而影响到核的重编程和重构胚的后续发育,此外还给卵母细胞带来机械损伤。

2.2 化学诱导去核法

其机理是在极体排出阶段,采用干扰染色体分离或纺锤体功能的化学试剂,使所有染色体与纺锤体牢固结合,同时蛋白合成抑制剂抑制细胞周期蛋白B合成,降低促成熟因子浓度,极体借助于惯性将染色质和纺锤体带出胞外,达到去核的目的。脱羰秋水仙碱(demecolcine,DC)是目前最常用的化学诱导去核剂。与盲吸法等建立在显微操作系统基础之上的机械去核法相比,化学去核法程序简单、机械损伤小、胞质丢失少、重复性好、适合大规模卵母细胞去核,具有很乐观的应用前景。

3 重构胚激活因素

重构胚的激活是体细胞克隆技术的关键环节,体细胞克隆胚胎的充分激活是保证胚胎正常发育的先决条件,只有在去核卵母细胞充分激活的情况下才可以指导移入的核发生重编程(reprogramming)。目前,动物细胞核移植的总效率很低,这可能与卵母细胞未被充分激活有关。由于化学激活方法能大大提高体细胞克隆胚胎的激活效率,许多研究者使用重复性好、结果较稳定的化学方法来激活卵母细胞,近年来已成为小鼠、牛、猪、山羊等体细胞克隆成功的重要原因。在此基础上,科学家们经过不断的努力,核移植的成功率不断提高。

常用的重构胚的激活物质有乙醇、氯化锶、放线菌酮、离子霉素和6-DMAP。另外还有电激活法。乙醇是发现较早的一种化学激活剂,其对卵母细胞的激活主要是通过水解细胞膜上 4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)产生1,4,5-三磷酸肌醇(IP3),从而诱发细胞内源钙释放到细胞质,提高细胞内的钙浓度。尽管乙醇对克隆胚的激活无种间特异性,但不同动物克隆胚对乙醇激活的反应不同。关于氯化锶(SrCl2)引起激活的机制,有人认为Sr2+作为与Ca2+同族的二价阳离子,可能是通过细胞膜上的Ca2+离子通道进入细胞内,并进入钙库(内质网和线粒体等),置换出内源钙,释放入胞质中,引起Ca2+离子波动,导致卵母细胞的激活。放线菌酮是一种蛋白质合成抑制剂,通过作用80 S核糖体抑制肽链的移动,从而抑制蛋白质的合成；单独的放线菌酮不能使猪体外成熟卵母细胞激活,其机制尚不清楚,可能是猪卵母细胞对其不敏感,只有与其他刺激因素联合使用时,才起到协同促进的作用,这也说明,放线菌酮引起的卵母细胞激活不是通过Ca2+被动起作用的,而是通过抑制有关蛋白质的合成起作用。SrCl2与放线菌酮联合使用对猪卵母细胞的激活有协同促进作用。离子霉素是一种近年来发现的高效Ca2+载体,也是一种有效的人工激活剂,已被人们广泛地应用于哺乳动物卵母细胞的激活中。离子霉素并不直接引起Ca2+的跨膜转运,而是动员细胞内的Ca2+,依次触发Ca2+内流。尽管离子霉素能激活受体卵母细胞,但只有与蛋白质磷酸化抑制剂6-DMAP和蛋白质合成抑制剂放线菌酮协同作用,才可以有效地被激活；6-DMAP是蛋白磷酸化抑制剂,它能阻止蛋白质的磷酸化进而抑制成熟促进因子和细胞静止因子的活性。

电激活是应用较为广泛的一种激活卵母细胞的方式,其激活卵母细胞并不是因为电场本身激活了卵母细胞,而是电脉冲使卵母细胞膜的磷酸二酯双分子结构的稳定性发生改变,细胞膜上形成很多可恢复的微小孔洞,使细胞外(介质)中Ca2+进入细胞,或通过激活IP3系统诱导细胞内钙库释放Ca2+,并使胞质内Ca2+浓度升高,从而引起卵母细胞的激活,电场强度和脉冲宽度是电激活的2个重要的参数,与细胞膜上孔洞的形成有关。

4 小结

不断地解决克隆技术在生产实践中出现的问题 ,以期完善克隆技术理论体系、提高克隆效率、促进体细胞核移植为核心的克隆技术的转基因动物研究的发展,运用克隆技术造福人类。

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