新疆北部地区奶牛子宫内膜炎主要病原菌的分离鉴定及其血细胞成分分析

张银亮,陈创夫,乔 军,刘贤侠,王利晓,余胜利,胡朝辉

(1.石河子大学动物科技学院,新疆 832003;2.新疆地方与民族高发病实验室,石河子 832003;3.新疆天康生物技术股份有限公司;4.新疆生产建设兵团农七师128团奶牛场)

奶牛子宫内膜炎是奶牛最常见的产科疾病,主要病因是奶牛产犊后产道尚未恢复完全,牛场环境中致病菌较多,奶牛产后抵抗力较弱,病原菌趁机侵入产道,造成奶牛子宫内膜等处产生炎症。子宫内膜炎对奶牛的生产性能有很大影响,如产奶量下降、人工授精次数增加、妊娠可能性和受孕率降低等,致使奶牛淘汰率增高,给奶牛业造成巨大的经济损失[1],其中以临床型子宫内膜炎危害最为严重,它可使产后初配天数和受孕天数相应增加29.81 d和50.67 d[2]。当前,血液学研究已成为研究疾病病理发生发展的一种重要手段。本实验针对新疆乌鲁木齐、昌吉、石河子、奎屯奶业较为发达地区的6个规模化奶牛场进行子宫内膜炎致病菌的分离鉴定,并对其中19头患子宫内膜炎奶牛和8头健康奶牛进行血细胞成分分析测定,旨在明确引起奶牛子宫内膜炎的主要病原菌种类,并探讨子宫内膜炎患牛和健康牛血细胞成分的关系。

1 材料与方法

1.1 动物及采样材料 奶牛为引进澳大利亚荷斯坦牛或中国荷斯坦牛,来源于新疆乌鲁木齐、昌吉、石河子、奎屯6个规模化牛场,根据直肠检查和子宫分泌物的观察,选取子宫内膜炎患牛75头和健康奶牛8头,供采样用。另选成年母兔8只、公兔1只用于配种(购于石河子大学实验动物中心)。采样材料为高锰酸钾、新洁尔灭、酒精棉球、阴道开膣器、一次性无菌注射器、一次性输精枪外鞘、灭菌棉签、酒精灯、封口膜等。

1.2 培养基、染色剂及参考菌株 营养肉汤、营养琼脂、葡萄糖蛋白胨酵母提取物增菌培养基(PYG)、厌氧菌血琼脂(CDC)、血琼脂基础、吐温-80、脑心浸液培养基(BHI)、伊红美兰琼脂(EMB)、麦康凯琼脂、芽孢染色液(购于杭州天和生物试剂有限公司)、革兰氏染色液(按照文献[3]配制)等。参考菌株无乳链球菌、停乳链球菌为本实验室保存,普通变形杆菌CMCC49027、金黄色葡萄球菌 ATCC29213、铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠埃希氏菌ATCC35218、化脓性链球菌ATCC19615、沙门氏菌CMCC50094、化脓性链球菌ATCC19615、蜡杆芽孢杆菌CNCC63301等均购于杭州天和生物试剂有限公司。

1.3 生化鉴定试剂 肠杆菌科细菌生化编码鉴定管(批号090507)、葡萄球菌属细菌生化编码鉴定管(批号090428)、链球菌细菌生化编码鉴定管(批号090520)、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘露醇、甘露糖、乙酰胺、甘露糖、精氨酸脱羧酶、D-核糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、肌醇、水杨素、木糖、山梨醇、卫茅醇、肌醇、七叶苷、柠檬酸盐、淀粉、明胶、紫牛乳(批号090601)靛基质试剂、蛋白胨水、VP试验甲液、VP试验乙液、甲基红(MR)试剂、葡萄糖磷酸盐胨水、硝酸盐还原试剂(甲)、硝酸盐还原试剂(乙)、硝酸盐(还原)(批号090506)等均购于杭州天和生物试剂有限公司。

1.4 细菌分离与鉴定

1.4.1 采样 保定子宫内膜炎患牛,先掏空直肠内宿粪,然后用0.1%的高锰酸钾溶液清洗外阴,再用酒精棉球擦拭外阴,用灭菌开膣器打开阴道,由助手用一次性输精枪外鞘沾取炎性分泌物并迅速投入营养肉汤和PYG液体培养基中,迅速带回实验室培养。用一次性无菌注射器尾静脉采血并在4 h内送实验室检测。

1.4.2 细菌分离 经过24 h培养的菌液分别在营养琼脂平板、CDC厌氧血平板、血平板、麦康凯平板、伊红美兰平板做四区划线培养12～48 h,再根据菌落形态、溶血性、革兰氏染色等特点挑取单菌落进行纯培养,后用终浓度为25%的甘油管-80℃保菌。

1.4.3 细菌鉴定 根据细菌在培养基上的生长情况和革兰氏染色情况分为G+球菌、G-杆菌、G+杆菌、G-球菌4大类,以确定生化反应项目[4]。G+球菌:镜检呈葡萄串状且经过氧化氢酶试验阳性者进行葡萄球菌鉴定,镜检呈链状且经过氧化氢酶试验呈阴性者进行链球菌鉴定;G-杆菌:乳糖试验阳性者,应用肠杆菌科生化微量鉴定管进行鉴定。乳糖试验阴性者,可根据菌落生长情况和 MR试验阴性者确定为铜绿假单胞菌,阳性者且迁徙生长为变形杆菌,归于肠杆菌科;G+杆菌:根据其在普通平板上菌落形态呈蜡状且通过芽孢染色可以看到芽孢初步鉴定为蜡样芽孢杆菌并进行相应的生化反应;G-球菌:未分离到。

1.4.4 细菌致病性实验 按照文献[5]方法做改进,对所分离的细菌进行致病性检验。选择成年健康母兔,利用自制的子宫灌注器吸取分离到的大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌24 h培养物,按1∶1比例混合导入母兔子宫内,混合菌液分别接种模型组1:2只健康未孕母兔;模型组2:2只产后3 d母兔;模型组3:2只产后3 d并用韧物刺激产道的母兔;另取2只健康母兔做对照,用同样方法在子宫内注入灭菌肉汤。每3 d接种1次。每天10:00时和22:00时测量母兔体温并观察母兔阴道分泌物,待见阴道流出大量分泌物后将母兔扑杀,取子宫炎性分泌物进行细菌培养,并观察与先前接种的细菌是否一致。

1.5 血细胞成分分析 PE-6800Vet全自动血细胞分析仪,深圳市普康电子有限公司生产。血细胞分析仪应用试剂PE-L01型溶血剂(表面活性剂20 g/L、NaCl 6 g/L、缓冲剂4 g/L)、清洗液(浓缩)PE-CO2型(蛋白水解酶 250 mL/L、NaCl 7.5 g/L、食品着色剂 0.2 g/L、防腐剂2.5 g/L、缓冲剂4.0 g/L)、清洗液(强力)PE-CO3型(次氯酸钠溶液120 mL/L、NaCl 8.6 g/L、表面活性剂2 g/L、防腐剂0.5 g/L、缓冲剂4.0 g/L)。对产后子宫内膜炎患牛和正常奶牛白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)、淋巴细胞(LYM)、中间细胞(MID)、粒细胞(GRAN)、红细胞平均体积(MCV)、红细胞分布宽度SD(RDW-SD)、红细胞分布宽度 CV(RDW-CV)、血小板平均体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、红细胞压积(HCT)、平均血红蛋白含量(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)、血小板压积(PCT)含量等进行测定。

2 结果

2.1 奶牛子宫内膜炎致病菌的分离鉴定结果 通过染色观察、选择性培养基培养等鉴别方法,从75份子宫分泌物样中分离出葡萄球菌、链球菌和肠杆菌等189株,全部为混合感染。生化鉴定结果:共分离得到金黄色葡萄球菌56株(占29.62%),大肠埃希氏菌52株(占27.51%),铜绿假单胞菌 25株(占13.23%),蜡样芽孢杆菌22株(占11.64%),无乳链球菌17株(占8.99%),停乳链球菌10株(占5.30%),沙门氏菌 3株(占1.59%),中间葡萄球菌2株(占1.06%),表皮葡萄球菌、普通变形杆菌各1株(各占0.53%),严格厌氧菌未分离到。详见表1。

表1 各分离菌株的种类及部分特性

2.2 细菌致病性试验结果 母兔进行子宫内人工接种细菌后,除空白对照组外其余各组母兔接种第3天后即可看到少量脓性分泌物从母兔阴道流出且伴发阴道红肿等症状,待母兔有大量炎性分泌物流出时,将炎性分泌物涂片镜检,可见大量的脓球、白细胞和少量脱落的子宫内膜上皮细胞碎片;将子宫分泌物进行细菌培养鉴定均可见先前灌注的细菌。模型组1和对照组初期体温略有升高,后基本恢复正常;模型组2和模型组3母兔均表现体温升高。详见图1。

图1 母兔攻菌期间的体温变化

2.3 子宫内膜炎患牛与健康奶牛血细胞成分比较子宫内膜炎患牛与健康奶牛血细胞成分比较见表2。SPSS 11.5统计软件进行数据分析表明,健康奶牛组和奶牛子宫内膜炎组的LYM、GRAN、MCH、PDW、PCT差异极显著(P＜0.01)。其余指标差异不显著(P＞0.05)。

3 讨论与小结

奶牛子宫内膜炎的发病原因比较复杂,产后4周子宫内细菌感染是引发该病的主要原因[6-7]。据报道,引起奶牛子宫内膜炎的细菌有葡萄球菌、链球菌、大肠埃希氏菌、变形杆菌、克雷伯氏菌、棒状杆菌和支原体等[8-11],本实验对新疆奶业发达地区6个规模化奶牛场的75例子宫内膜炎病进行细菌分离鉴定,共分离出葡萄球菌、大肠埃希氏菌、链球菌等,基本与国内外的报道一致。

表2 子宫内膜炎患牛与健康奶牛血细胞成分比较

本次细菌致病性试验以母兔为实验对象,建立子宫内膜炎模型,结果表明,正常母兔子宫内人工接种细菌后初期母兔表现出体温升高等,后期母兔的各项指标均恢复正常,说明正常母兔的子宫自净功能很强,产后母兔组和产后并用韧物刺激产道的母兔组均表现出体温升高并伴发有炎性分泌物从阴道流出,说明产后和产道损伤的母畜更易受到细菌的侵袭并引发子宫内膜炎。这就要求在生产过程中要加强母畜的管理,产前要给予母畜一定的锻炼,减少难产的发生,产后要及时补充营养以增强母畜的免疫力,并做好消毒工作,最大程度上减少子宫内膜炎的发病。

本次血细胞分析结果表明,子宫内膜炎患牛血液中血红蛋白及红细胞的含量均普遍低于正常值,淋巴细胞比例下降,这与麻延峰[12]的报道结果一致。淋巴细胞是一种免疫活性细胞,不具有吞噬功能,主要诱导机体产生抗体。当淋巴细胞比例下降,说明奶牛自身的免疫力低下,导致子宫内一些新致病菌大量繁殖而引发子宫内膜炎。粒细胞降低是由于试验选取化脓性子宫内膜炎病例,由于患牛处于产后早期能量负平衡与免疫力低下状态,因此其吞噬能力大大降低,这提示我们应该做好围产后期饲养管理。由于新疆引进了大量的澳洲荷斯坦牛,经查阅文献资料,未发现新疆地区引进奶牛血常规指标的参考数据,故本研究采用了新疆本地饲养条件下的奶牛的参考值。由于奶牛的饲养方式、地域环境、品种、气候条件等因素的影响,新疆奶牛集中饲养地区尚需进一步抽测不同发育阶段、不同产后阶段、不同年龄(胎次)、产奶水平、不同饲养方式下的奶牛的血常规指标,以便初步建立血细胞成分的参考标准,对生产更具有实际意义。

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