新疆部分地区结核分枝杆菌rpoB基因突变与对利福平耐药相关性检测

王 仙 ，袁 俐 ，李永祥 ，王远志 ，姜素华 ，吴万贵 ，贾 卫

（1.新疆石河子大学医学院，新疆石河子 832000；2.新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心，新疆乌鲁木齐 830002）

我国是全球结核病高发国家之一，全国第4次结核病流行病学调查显示，新疆结核病的发病率高于全国平均水平[1]。新疆和田地区的监测报告[2]进一步显示对利福平的耐药率不是最高，但多数耐药菌株均有利福平耐药现象，目前多数研究表明对利福平的耐药与rpoB基因突变有关系，因此检测对利福平的耐药有可能作为耐多药患者的监测指标。本研究对新疆部分地区结核分枝杆菌利福平耐药菌株进行因rpoB初步分析，了解突变情况，为多耐药检测提供依据。

1 资料与方法

1.1 菌种与标本来源

H37RV标准株由中国药品生物制品鉴定所菌种保藏中心惠赠，每批试验均以该菌株作为参比对照。从380份痰样本中获得98例临床分离株，62株结核分枝杆菌初始耐药分离株，其中单利福平耐药株4株，多耐药10株。标本来自新疆伊犁、阿克苏和石河子。根据“结核病诊断细菌学检验规程”进行菌种鉴定，以绝对浓度法进行药物敏感实验。

1.2 PCR扩增

使用解放军309医院提供的rpoB扩增试剂盒，出现240bp条带即为阳性。

1.3 DNA测序

取耐利福平结核分枝杆菌的PCR产物送上海生物工程公司测序。

2 结果

2.1 PCR扩增结果

以结核分枝杆菌标准株（H37RV）DNA为对照，用上述引物扩增62株结核分枝杆菌初始耐药分离株，其中14株RFP耐药株，经2%琼脂糖凝胶电泳，均扩增出1条片段长度为240bp的产物。

2.2 直接测序分析

对14株利福平耐药株的PCR产物直接测序，与结核分枝杆菌rpoB基因序列（Genebank L27989）经Blast分析比较。8株是在531位密码子突变（TCG-TTG，Ser-Leu），4株单耐药的均在此位点；2株是在516位密码子突变（GAC-GGC，Asp-Gly）；1 株是在 526 位密码子（CAC-GAC，His-Asp）。 结果显示11株发生了基因突变，突变率为78.6%（11/14）。

3 讨论

目前研究认为，对RFP耐药主要是由于药物作用于靶分子RNA聚合酶的β亚单位的编码基因（rpoB基因）突变所致。突变引起β亚单位上关键氨基酸的改变，从而发生构象改变，使药物失去结合位点，这种突变与RFP耐药有密切关系。国内外报道表明，90%～95%的RFP耐药菌株在rpoB基因核心区的69bp区域内有突变[3-4]，这些突变包括点突变、缺失、插入等，最近又发现在其氨基酸终止区域的突变。迄今为止在核心区的突变尚未发现无意义突变。最常见的突变位点是 531位 TCG 变为 TTG（Ser变为 Leu），占 38.1%；526位CAC变为 TAC（His变为Tyr），占21.6%；516位GAC变为GTC（Asp变为Val），占5.7%。因此，通过分析rpoB突变可判断细菌对利福平的药敏结果。

本研究结果显示，rpoB基因突变形式为点突变，单耐药株表现为单一位点突变（531位），耐药株中531位突变的占主要形式（57.1%，8/14），多耐药株在 531、516 和 526 位均存在，未发现文献报道的联合突变类型，其中，1例除了在526位存在突变外，在570位也存在突变位点。由于试剂盒扩增rpoB基因498～574位密码子，测序后突变位点可能在所扩增片段的两端，而测序时两侧碱基并不准确，所以不能肯定是否有明确的突变存在。由于新疆结核病患病率高，有必要对耐RFP的菌株进一步深入研究，进而阐明对耐药程度、基因不同区域、突变形式及频率与多耐药的关系。

[1]全国结核病流行病学抽样调查技术指导组.第四次全国结核病流行病学抽样调查报告[J].中国结核和呼吸杂志,2002,25(1):3-7.

[2]贾卫,吴卫东,顾小明,等.新疆和田地区结核病耐药监测调查[J].地方病通报,2008,23(1):46-52.

[3]Morris S,Bai GH,Suffys P,et al.Molecular mechanism of multiple drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis[J].JInfect Dis,1995,171(4):954-968.

[4]Telenti A,Imboden P,Marchesi F,et al.Detection of rifampin-resistant mutations in Mycobacterium tuberculosis[J].Lancet,1993,341(2):647-650.