微生物物证检验进展

张幼芳浙江警察学院，浙江杭州 310053

进入21世纪后，法庭科学中一个新的专业——微生物物证检验逐渐兴起，这一方面是由于社会发展存在的问题，将微生物作为武器进行恐怖袭击和犯罪的案例时有发生；另一方面，也因为生物科学技术的发展，微生物物证检验技术得到了不断发展。

微生物物证主要为细菌、病毒、真菌等可能涉及犯罪的微生物。物证检材可以是生物制剂的原始物品，被微生物制剂污染的物品，盛放微生物制剂的容器，被微生物感染的人或动物样本，携带有现场微生物的物品等。

1 微生物物证的种类

1.1 微生物作为生物恐怖武器

生物恐怖是造成社会恐怖的最严重的犯罪形式之一。美国“9 ·11”之后出现的炭疽杆菌信件攻击事件，让我们看到生物恐怖袭击已经从可能变成为现实。该类微生物物证常为微生物制剂原始物品，通过邮件或其他方式转移到被害人，常见检材为被微生物制剂污染的物品，盛放微生物制剂的容器，通过检测，可确定是否为生物恐怖活动，为何种致病微生物，从而为打击犯罪，采取相应的保护预防措施提供依据。

1.2 微生物作为生物犯罪手段

生物犯罪是指故意使用致病微生物导致人、动物和植物发病，威胁人类健康，破坏农畜牧业发展和食品安全的犯罪行为[1]。如艾滋病人故意传播艾滋病毒，导致他人患病[2]。常用检材为被微生物感染的人或动植物样本，通过检测，确定微生物的来源，从而认定犯罪。

在有些案件中，涉嫌病人在医院内的感染，为确定医院是否负有责任，也需对微生物的来源进行认定。

1.3 微生物作为犯罪的见证者

微生物物证可在案犯实施犯罪过程中发生转移，如发生在野外的案件，嫌疑人常在不经意间将现场的泥土黏附在鞋子、衣服上携带走，通过检测泥土中的微生物，将其与现场泥土比对，可将嫌疑人与犯罪联系起来。

2 微生物物证的检验

微生物物证检验的检测技术主要有物理分析技术、免疫学分析技术、化学分析技术和DNA分析技术，其中，DNA分析技术是微生物物证检验最有力的方法，不仅可以准确检测微生物种类，还可能鉴别菌毒株或亚株；同时，DNA作为法庭证据，也容易被人们接受。

在聚合酶链式反应（PCR）技术应用之前，用于微生物检验的DNA分析技术仅局限于杂交技术和限制性片段长度多态性（RFLP）分型，这些方法所需检材量大，耗时、费力，不易自动化操作。对特定序列的扩增手段为微生物检测提供了宽广的技术基础。

2.1 核糖体基因分析

细菌中有3种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA， rRNA基因有保守区和可变区，16S rRNA的对应基因为16S rDNA，在3种核糖体RNA中，5S rRNA因核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类，23S rRNA含有的核苷酸约为16S rRNA的两倍，分析比较困难，16S rRNA所含核苷酸适中，又具有保守型和存在普遍性，序列变化与进化距离相适应，检测技术流程为，先将细菌进行培养，提取基因组DNA，然后根据已发表的16S rDNA序列设计引物，进行PCR扩增，然后电泳分离回收扩增产物，对扩增产物测序，将测序结果与核糖体基因数据库（现在已有数千种微生物16S rRNA基因序列数据）进行比对，确定该未知菌的种属。

不幸的是，在病毒中没有可用于区分种属的共同的基因。但是在真菌中，核糖体转录区包括5S、5.8S、18S和28SrDNA，18S、5. 8S、28S rDNA基因序列进化缓慢而相对保守，但这3个基因序列之间的ITS序列的进化则相当迅速，因而其序列广泛用于真菌各级水平的系统学研究[3]。

2.2 多位点序列分析（M LST）

仅仅根据一个或2个DNA区域鉴定微生物种类往往分辨率不够，而且有些微生物种类的rRNA基因序列相同或者非常接近，为了提高微生物种类鉴别率，另外一些保守或共同的基因组区域可用于检测，多位点序列分析（MLST）检测5～7个管家基因间450bp～500bp片段，大多数的细菌种类可通过MLST鉴别。

2.3 多位点VNTR分析（MLVA）

与真核生物一样，细菌基因组DNA中也存在重复序列，许多细菌可通过检测这些VNTR区域进行鉴别，如美国2001年炭疽信件攻击事件中的炭疽孢子用多位点VNTR分析（MLVA），鉴定为艾姆斯张力菌株，该类菌株属美国军方实验室使用。

MLVA根据PCR扩增产物片段大小分型，扩增片段直接与DNA片段重复次数相关，扩增产物通过电泳分型，现在一般采用毛细管电泳，自动化程度高。MLVA的局限性在于，因为该法检测的是突变率较高的部位，因此，不适合于进化关系研究。

2.4 单核苷酸多态性（SNP）分析

另一种用于微生物种属鉴别的方法为单核苷酸多态性（SNP）分析法，现在一般用美国ABI公司的ABI PRISM SNaPshot® 试剂盒，用这种试剂盒检测速度快、稳定性好、可自动化操作，电泳分型和荧光检测所需技术在大多数实验室都能完成。

虽然DNA检验在微生物鉴别方面已取得一定成果，但其分辨效率仍远低于其他传统物证检验，距侦查破案的实际需求仍有一定距离，还需要不断地进行研究。一方面，应建立新的更加快速的检测微生物多态性的方法；另一方面，要做好基础工作，建立完备的微生物DNA数据库。

[1]R Breeze, B Budowle and S Schutzer. Microbial Forensics[M].Bur l ington: ElseVier Academic Press，2005.