鱼糜漂洗水中鱼蛋白的提取研究

徐 律 杨金生 丁迎燕 夏松养

鱼糜制品是以鱼类为原料经采肉、漂洗、精滤、脱水、搅拌、成型、加热等工序加工而成的，营养价值高，深受消费者喜爱。鱼糜生产中，为了得到弹性好、色泽白的优质鱼糜，采肉后的碎鱼肉一般需进行漂洗。漂洗过程中一定量的水溶性蛋白质溶于水中，作为废水而废弃，十分可惜。鱼肉肉质鲜嫩美味，其中所含的必需氨基酸齐全，各种氨基酸组成合理，易被人体消化吸收利用，是一种优质蛋白质。从漂洗水中提取的蛋白，可作为蛋白源添加到食品中供人食用，也可以添加到饲料中，供各种动物养殖用，用途广泛。本文通过对鱼糜漂洗水中蛋白质的提取方法的研究，为科学利用废水鱼蛋白提供技术依据[1]。

1 实验材料、主要仪器与试剂

1.1 实验材料

原料（鱼糜漂洗水）：鱼糜加工厂取样。

1.2 主要仪器、试剂

低速大容量离心机、冷冻离心机、氮蒸馏装置、pH计、冷冻干燥机、套式恒温器。三氯化铁、磷酸、明矾、乙酸。

2 实验方法

2.1 测定方法

水分的测定[2]按照GB；蛋白质含量的测定采用凯式定氮法；pH计测定pH值。

2.2 操作方法

2.2.1 等电点沉淀提取法[3-5]

2.2.1.1 工艺流程

原料→过滤处理（去渣）→调节滤液的pH值（用磷酸或乙酸）→pH值的测定→静置→去除上清液→干燥→称重

2.2.1.2 试剂的准备

将磷酸稀释到原来浓度的0.1%、0.2%、0.4%，乙酸稀释到原来浓度的0.2%、1.0%、4.0%，以上6种不同的酸溶液作为pH调节剂调节溶液的等电点。

①原料处理

用纱布（一层）对原液进行过滤，除去滤渣（滤渣可回收利用），使滤液看上去无明显的大颗粒悬浮物。

②滤液pH值的调节

准备 40 支试管，标号为 A1、A2…A19、A20，每支试管均加入 8.0 ml滤液。其中溶液 A1、A2…A9、A10以磷酸为pH调节剂，溶液A11、A12…A19、A20是以乙酸为pH调节剂。pH调节剂加入各试管中后，添加自然水，保证各试管溶液的体积达到10.0 ml。操作如下：

向 A1～A6分别加入 0.1% 磷酸 0、0.5、0.8、1.2、1.6、2.0 ml；向 A7～A9中分别加入 0.2% 磷酸 1.4、1.6、1.8 ml；向A10中加入0.4%磷酸1.2 ml，各加入滤液8 ml，并加水定容至10 ml。

向 A11～A14分别加入 0.2% 乙酸 0、0.2、1.0、1.8 ml；向 A15～A16中分别加入 1.0%乙酸 0.5、1.0 ml；向 A17～A20中加入 4.0%乙酸 0.8、1.0、1.2、2.0 ml；同时各加入滤液 8 ml，并加水定容至 10 ml。另取试管 B1、B2…B20，做平行试验，操作同上。

③pH值的测定

40份溶液配制完后，摇匀，快速用已调节好的pH计测得各溶液的pH值。

④离心干燥处理

溶液 A1～A20：静置 90 min，将 20份溶液分别倒入离心管内，在4 200 r/min下，离心15 min。除去上清液，在60℃下干燥约10 h，至恒重，称量。

溶液 B1～B20：静置 90 min后，产生分层现象，挑选出分层现象明显的试管，除去上清液，取絮状沉淀物在干燥皿中称量，在60℃的干燥箱内干燥约10 h，至恒重，称量。那些无明显分层现象产生的溶液，提取物质量记为0。

2.2.2 添加凝聚剂提取法[6-7]

2.2.2.1 工艺流程

原料→过滤处理（去渣）→添加凝聚剂→静置观察现象（混浊度）→去除上清液→干燥→称量

2.2.2.2 操作要点

①原料处理：用纱布对原液进行过滤，除去滤渣（回收利用），滤液中无明显的大颗粒悬浮物。

②凝聚剂的添加方法：向试管A21～A30中分别加入 0.1%三氯化铁 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0 ml，各加入滤液 8.0 ml，用水定容至 10 ml。

向试管 A31～A40中分别加入 0.1%氯化铝 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0 ml，各加入滤液 8.0 ml，用水定容至10 ml。

向试管 A41～A50中分别加入明矾 0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0mg，各加入滤液定容至 10.0 ml。

③离心干燥：分别把上述溶液摇匀静置，观察沉淀情况,当溶液有明显的絮状沉淀物产生时（约90 min），取出，去上清液，沉淀物置于干燥皿中，在60℃的烘箱内（约10 h）烘至恒重，称量。那些无明显分层现象产生的溶液，提取物质量记为0。

3 实验结果及讨论

3.1 原料的测定结果

经测定，原料(鱼糜漂洗液)中含蛋白质0.64%、水分98.70%；滤渣中蛋白质占15.4%、水分占82.30%；滤液中蛋白质含量为0.18%、水分99.74%。滤液及滤渣的固形物中蛋白质的纯度分别为：

P滤液=蛋白质（%）/[1-水分（%）]=[0.18%/（1-99.74%）]×100%=69.23%；

P滤渣=蛋白质（%）/[1-水分（%）]=[15.40%/（1-82.30%）]×100%=87.01%；

滤液的密度近似看成为1.0 g/ml。

可以看出滤渣中蛋白质的纯度竟达87.01%。滤液中仍含有较丰富的蛋白质，其干重可达0.18%，纯度也相当高，为69.23%，仍有很大的利用价值。

3.2 等电点沉淀法的结果及分析

3.2.1 溶液中蛋白质等电点的确定

经测定，室温下，溶液用磷酸为pH调节剂时：当pH值大于或等于6.28时，溶液基本保持原状，不出现混浊现象。pH值小于6.28时，溶液随着酸度的增加，溶液开始出现混浊现象了，溶液的混浊度先逐渐明显后又渐渐变小了；当pH值达5.28时，溶液混浊现象随酸度增加又开始消失。因此可以得出以下结论：滤液的等电点最接近管A5所配溶液，即pH值约为5.28。

以乙酸为调节剂的溶液A11～A20对应的pH值如表1所示。

表1 溶液A11～A20（B11～B20）对应的pH值（乙酸）

在室温下，滤液在使用乙酸调节pH值时，滤液的等电点接近于溶液A16的pH值，其值为5.35。

3.2.2 磷酸对提取效果的影响

①溶液在不同pH值下与离心后提取物质量之间的关系图：

图1 pH值与离心提取物质量关系

由图1可得：空白样本A1经过离心提取物的百分含量P1为55.56%。

式中：MA1——溶液A1离心干燥提取的质量，同理MA5、MB1等；

V溶液A——滤液的实际加入体积；

P理论——滤液中蛋白质的理论百分含量。

当pH值为5.28时，即溶液在其蛋白质的等电点下，离心提取最多的量P2为90.28%。

②产生明显分层现象后（静置约90 min），在溶液B1～B10中，选出分层的溶液，除去上清液，取絮状沉淀物干燥后的质量与对应的pH值，如图2可看出在pH值为5.28时，即在等电点下，其沉淀量达到最大，提取率P3为83.33%。

图2 絮状沉淀物的质量与pH值的关系

3.2.3 乙酸对提取效果的影响

①溶液A11～A20静置，离心，干燥，提取物质量与其对应的pH值之间的关系见图3。

图3 pH值与离心干燥质量的关系

由图3可得：

在pH值为6.69的情况时，空白式样A1，离心后蛋白质提取率P4为56.25%。

当pH值为5.35时，即等电点下，离心蛋白质提取率P5为85.41%。

②产生明显分层现象产生后（约100 min），在管B11～B20中，选出有分层现象的试管，去上清液，取絮状沉淀物干燥后所得质量与对应的pH值的关系，见图4。

由图4中可看出，当pH值为4.0～6.5之间，均有沉淀物出现，在其等电点下（pH值为5.35），其沉淀量达到最大。其提取率P6为79.86%。

图4 沉淀物质量与pH值的关系

3.2.4 磷酸与乙酸对提取效果影响的对比分析

从提取率来看，磷酸的提取率略高于乙酸，并且在反应沉淀出的速率上来看，磷酸的效果优于乙酸。在提取物的质量上基本都能保证安全，新鲜。

从以上对比中可得，以磷酸作酸度调节剂更适合。

3.3 添加凝聚剂沉淀法的结果及分析

3.3.1 三氯化铁对提取效果的影响

以三氯化铁为凝聚剂，加入溶液A21～A30，在时间为0、30、80 min时溶液的混浊情况见表2。

表2 三氯化铁凝聚溶液的情况

从表2可看出，在一定范围内，刚开始的混浊度随着三氯化铁的加入量的增加而增加，当投入量达到一定量后渐趋于一个稳定数值。刚开始越混浊的溶液到最后也就越清晰，越清晰则说明沉淀得越完全。去除上清液，将絮状沉淀物干燥，所得的量与添加的三氯化铁的量的关系见图5。

图5 三氯化铁的量与提取物的量的关系

从图5可看出，1.0 ml的1%的三氯化铁溶液于每8.0 ml溶液中，加1 ml水，即达接近最大值的提取率 P7为79.86%。

3.3.2 氯化铝对提取效果的影响

以氯化铝为凝聚剂，加入 A31～A40溶液，经 0、30、80 min，溶液的混浊情况见表3。

表3 氯化铝凝聚溶液的混浊情况

从表3中可知，其混浊与澄清趋势基本与添加三氯化铁溶液的变化趋势相同。

氯化铝的量与提取物质量的关系见图6。

图6 氯化铝的量与提取物质量的关系

如图6可得1%的氯化铝溶液为1.2 ml于8.0 ml滤液中，加0.8 ml水，其提取率P8为77.78%。

3.3.3 明矾对提取效果的影响

溶液A41～A50是以明矾作为凝聚剂，经0、30、80 min，溶液的混浊情况见表4。

表4 明矾作凝聚剂时溶液的混浊情况

从表4中可看出，其混浊度与澄清趋势与三氯化铁和氯化铝的变化趋势基本相同。

将上清液去除，絮状沉淀物直接进行干燥，其量与沉淀物质量的关系如图7。

如图7可见，明矾投入量为1.0mg时，沉淀物P9得率基本趋于最大，P9为75.69%。

图7 明矾加入量与沉淀物质量的关系

3.3.4 使用各种凝聚剂的对比分析

以上三种凝聚剂，在其一定范围内，沉淀物的质量都随着凝聚剂投入量的增加而增加，当投放量达到一定数值后，可沉淀出的物质基本趋于饱和。在最适点下提取率的高低顺序为:三氯化铁＞氯化铝＞明矾。

4 小结

由实验可知，鱼糜漂洗液中蛋白质的最适提取方法为等电点提取法，其提取条件在室温下，以0.1%磷酸调节pH值，所加体积比为：V溶液：V磷酸=5：1,静置时间约1 h，适当延长静置时间，沉淀效果更好，沉淀物中水分含量越少。

此方法操作简单，提取率高，提取影响因素小，成本低，适合于大量的生产。

[1]王天林.酶法水解草鱼鱼肉蛋白最适条件的研究[J].哈尔滨市食品药品监督管理局,2009(8).

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