龙虾壳聚糖的制备条件优化及其对断奶仔猪生长和免疫功能的影响

谭佩毅 蔡 香 丁 凯 徐学文 许平平 赵 婷

淮安地区水产资源丰富，特别是近年来随着人工养殖技术的发展，虾、蟹产量逐年递增，仅龙虾（螯虾）的年产量已经超过10万吨，而龙虾的壳大多是作为废物或垃圾处理，若能充分利用这些废弃物，从中提取壳聚糖，能够合理利用资源，提升水产品的附加值，在取得良好经济效益的同时，还能减轻这些废弃物对环境造成的压力，有效地变废为宝，保护环境。

壳聚糖具有抗菌、降脂等作用，并可促进动物免疫机能、改善肠道微生态环境，因此有望成为家畜饲用抗生素的替代品。利用壳聚糖开发绿色新型饲料添加剂，对于充分利用地方资源优势，促进区域经济与环境协调发展，具有重要的现实意义。本试验在探讨龙虾壳聚糖的制备条件优化的基础上，研究了壳聚糖对断奶仔猪生长和免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

虾壳，江苏天龙农牧科技发展有限公司提供；盐酸、氢氧化钠均为国产试剂纯；原子吸收分光光度计，乌氏粘度计等。

1.2 试验方法

1.2.1 壳聚糖的制备方法

称取100 g干净无杂质的虾壳，用1 000 ml浓度为5%的稀盐酸浸泡24 h。浸泡开始阶段反应剧烈，产气迅速，应不时搅拌，以免酸液和虾壳溢出容器。浸泡到一定时间后随时用pH试纸检测酸液的pH值，当接近中性时，续入新配酸液以保证脱钙反应进行彻底。脱钙后的甲壳经过水洗后，在浓度为5%的NaOH稀溶液中煮沸4 h，以除去其中的蛋白质。脱蛋白后的滤渣经过充分水洗干燥，得到甲壳素。

取一定量的甲壳素，按20 g/l的比例浸泡于浓NaOH溶液中，保温一定时间进行脱乙酰反应，其间不时用玻璃棒搅拌反应体系，以保证反应充分进行。反应结束后，冷却至室温，过滤，将滤渣用水洗至中性，干燥得到壳聚糖。

1.2.2 壳聚糖制备条件优化

1.2.2.1 处理温度的筛选

在45%碱浓度和处理时间2 h的条件下，设定8个不同的处理温度（60、70、80、90、100、110、120、130℃），每个处理温度各做6个重复，筛选有利于提高壳聚糖脱乙酰度的适宜处理温度。

1.2.2.2 处理时间的筛选

在45%碱浓度及已经筛选的适宜温度（110℃）下，设定 6 个不同的处理时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h），每个处理时间各做6个重复，筛选有利于提高壳聚糖脱乙酰度的适宜处理时间。

1.2.2.3 碱浓度的筛选

在已经筛选的适宜温度（110℃）和处理时间（1.5 h）下，设定6个不同的NaOH浓度（35%、40%、45%、50%、55%、60%），每个碱浓度各做6个重复，有利于提高壳聚糖脱乙酰度的适宜碱浓度。

1.2.3 壳聚糖脱乙酰度的测定

参考蒋挺大（2001）介绍的方法，采用酸碱滴定法测定。

1.2.4 动物试验方法

试验随机选取28日龄断奶仔猪48头，初始体重为（7.31±0.89）kg，按体重均等、遗传相近的原则分为对照组（基础日粮）和试验组（基础日粮添加500mg/kg的壳聚糖），每组6个重复，每个重复4头猪。常规管理，自由采食和饮水。试验日粮营养水平按照NRC（1998）配制（见表1）。

表1 日粮配方和营养水平

试验全期21 d，试验开始时测定初始体重，第14、21 d时进行称重、结料，统计平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和饲料转化率（FCR）等指标；于21 d对该猪采血测定淋巴细胞转化率及血清溶血素含量。

1.2.5 免疫指标测定方法

1.2.5.1 淋巴细胞转化率

从仔猪前腔静脉用肝素抗凝真空管采血4 ml，取10 ml离心管加淋巴细胞分层液6 ml，然后沿管壁缓缓叠加3 ml血，2 500 r/min离心30 min，取中间白细胞部分，用 3～5倍体积 RPMI-1640洗 3次，每次2 000 r/min离心10 min。然后将细胞悬浮于RPMI-1640完全培养液，用台盼蓝染色计数活细胞数（＞95%），调整细胞浓度为 2×106个/ml。

将淋巴细胞悬液加入96孔细胞培养板中，加入Con A（终浓度为5 μg/ml），另一组加入等体积的培养液为对照，培养体系为每孔 200 μl。置 5%CO2、37℃培养72 h。在培养结束前6 h，每孔加入10 μl MTT（初始浓度为5mg/ml），继续培养。培养结束后，每孔加入10%SDS-0.04 M HCl溶液 100 μl，继续培养 2 h，使紫色结晶完全溶解，用酶联免疫检测仪在570 nm波长下测定OD值。淋巴细胞转化率用刺激指数（SI）表示，SI=Con A刺激孔OD570nm/对照孔OD570nm。

1.2.5.2 血清溶血素含量

血清用生理盐水稀释200倍。取稀释的血清1 ml于试管中，依次加10%SRBC悬液0.5 ml，1：10稀释的补体（豚鼠血清）1 ml，摇匀。将试管(反应管)置37℃恒温水浴中保温10 min，取出后立即将管移入冰浴中，以终止反应。将各管于540 nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值(OD值)。

2 试验结果

2.1 壳聚糖制备条件优化试验结果

2.1.1 处理温度的筛选结果

由表2可以发现，处理温度对龙虾壳聚糖的脱乙酰度有显著影响。处理温度在60～110℃范围内，脱乙酰度随着温度的升高而增加（P＜0.05）；超过110℃趋于恒定，不再随着温度的升高而有显著提高，120、130℃与110℃相比，没有显著差异性（P＞0.05）。由此可以看出，温度在110℃以上是制备高脱乙酰度的龙虾壳聚糖适宜温度条件。

表2 不同处理温度对壳聚糖脱乙酰度的影响

2.1.2 处理时间的筛选结果（见表3）

由表3可以看出，处理时间对壳聚糖脱乙酰度有显著的影响，随着处理时间的延长，壳聚糖的脱乙酰度呈一次线性升高（P＜0.05）。其中，1.5、2.0、2.5 和 3.0 h 4个处理组间的脱乙酰度无显著差异，但均显著高于0.5 h处理组及1.0 h处理组，1.0 h处理组亦显著高于0.5 h处理组（P＜0.05）。由此可知，龙虾壳聚糖制备的处理时间在1.5 h以上为宜。

表3 不同处理时间对壳聚糖脱乙酰度的影响

2.1.3 碱浓度的筛选结果（见表4）

由表4可以看出，碱浓度的高低显著影响壳聚糖的脱乙酰度，随着碱浓度的增加，脱乙酰度显著升高（P＜0.05）。当碱浓度为50%时，壳聚糖的脱乙酰度达到91.10%，显著高于35%、40%和45%3个浓度处理组；50%、55%和60%三者之间差异不显著（P＞0.05）。由此可知，龙虾壳聚糖制备的处理碱浓度应在50%以上。

表4 不同碱浓度对壳聚糖脱乙酰度的影响

2.2 动物试验结果

2.2.1 生长性能（见表5）

从表5可知，在0～14 d壳聚糖组的平均日增重和平均日采食量优于对照组，但两组间没有显著性差异（P＞0.05）；在14～21 d 以及试验全期（0～21 d），两组间日增重和日采食量差异显著（P＜0.05）；14～21 d以及试验全期（0～21 d）壳聚糖组的饲料转化率优于对照组，但两组间没有显著性差异（P＞0.05），说明在日粮中添加500mg/kg的龙虾壳聚糖，对断奶仔猪具有一定的促生长效果，能提高断奶仔猪日增重和日采食量，改善仔猪生长性能。

表5 日粮中添加壳聚糖对断奶仔猪生长性能的影响

2.2.2 免疫功能（见表6）

表6 日粮中添加壳聚糖对断奶仔猪免疫功能的影响

从表6可以发现，龙虾壳聚糖能极显著地提高断奶仔猪淋巴细胞转化率（P＜0.01），显著地提高断奶仔猪血清溶血素含量（P＜0.05），改善仔猪的细胞免疫和体液免疫功能。

3 分析与讨论

迄今为止，已有许多资料报道了不同制备条件对壳聚糖脱乙酰度的影响。谢雅明（1983）提出了脱乙酰基的速度与碱液浓度和温度的关系：当NaOH浓度在30%以下时，不论处理过程中的温度多高，时间多长，只能脱除甲壳素中半数的乙酰基，即壳聚糖的脱乙酰度只能达到50%；反应温度越高，脱乙酰基的速度越快。碱液浓度为40%时，当反应温度保持在135～140℃，1～2 h即可基本脱净乙酰基；若温度在50～60℃之间，则需要24 h。朱岩（1997）研究表明，制备高脱乙酰度的壳聚糖可采取两种方法，一是在温度较低和处理时间较长的条件下制备，二是在温度较高和处理时间较短的条件下制备。前者需要的周期过长，后者时间短、产量高。而曹根庭等（1995）研究认为，在一定范围内，随着碱浓度、处理时间或处理温度的增加，开始时壳聚糖的脱乙酰度升高较快，之后则升高缓慢甚至有所下降。本试验以龙虾壳制取的甲壳素为原料，得出了相似的结果，在温度110℃以上，碱处理浓度50%、处理时间在1.5 h以上条件下，可制备脱乙酰度90%以上的高脱乙酰度龙虾壳聚糖。

本试验还发现，在日粮中添加500mg/kg的龙虾壳聚糖，对断奶仔猪具有一定的促生长效果，能提高断奶仔猪日增重和日采食量，改善仔猪生长性能，同时提高断奶仔猪淋巴细胞转化率及血清溶血素含量，改善仔猪的细胞免疫和体液免疫功能。

[1]蒋挺大.壳聚糖[M].北京：化学工业出版社，2001.

[2]谢雅明.可溶性甲壳质的制造和用途 [J].化学世界，1983（4）：118-121.

[3]朱岩.壳聚糖脱乙酰化度的测定及反应条件对脱乙酰化度的影响[J].荆门大学学报（自然科学版），1997,8（1）：1-9.

[4]曹根庭，周涛.高粘度、高脱乙酰度壳聚糖的研制.浙江水产学院学报，1995,14（4）：267-274.

[5]张彩芬,史彬林,马跃军,等.壳聚糖对仔猪细胞免疫和体液免疫机能的影响[J].黑龙江畜牧兽医(科技版),2009（11）：107-109.