葡萄糖氧化酶基因转化玉米及其后代的抗病性研究

刘昭军，邸 宏，李 铁，成 瑜，赵 曦，刘丽艳，王永斌，赵远玲，王广金，王振华

（1.黑龙江省作物与家畜分子育种重点实验室，哈尔滨 150086；2.黑龙江省农业科学院生物技术研究所，哈尔滨 150086；3.东北农业大学农学院，哈尔滨 150030）

玉米（Zea mays L.）是黑龙江省重要的粮食作物，随着种植面积的不断扩大，由于多年连作以及致病菌生理小种的不断进化，玉米病害越来越严重，直接影响玉米的生产。目前防治玉米病害的方法主要有化学防治、生物防治以及农业防治等等。随着基因工程技术在农作物育种上的广泛应用，培育了许多抗病虫转基因农作物品种，大大减轻了化学防病的环境危害并且防效显著。国外转基因玉米的研制开展较早，应用效果良好，目前已经有近百个抗除草剂、抗虫转基因玉米品种在生产上应用。我国玉米转化研究起步较晚，成功的报道不多[1-4]。

随着基因转化技术的深入和成熟，许多玉米转化方法得以研发，如农杆菌感染法[5-7]、基因枪法[2]、原生质体PEG介导法[8]、显微注射法[1]等均成功获得了转化植株。花粉管通道法是利用外源DNA涂抹柱头，滴入柱头切口或与受体植物自身的花粉混合，使外源DNA随着授粉受精过程沿花粉管渗入，经珠心通道进入胚囊，转化尚不具备细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。该方法具有操作简便、无基因型选择、外源基因纯合稳定所需时间短等优点，可与常规育种工作结合进行[9-10]。植物在受到病原微生物侵染以后，往往产生一系列防御反应，细胞内活性氧（Active oxygen species，AOS），包括过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（·OH）和超氧化物阴离子（O2-）等受诱导释放。其中过氧化氢不仅对病原微生物有直接的抑杀作用，而且和相关的AOS一起被认为在对植物的超敏反应和系统获得性反应中起十分重要的作用。葡萄糖氧化酶基因（Glucose oxidase，GO）它可以催化 β-D-葡萄糖氧化生成过氧化氢和葡萄糖酸[11-12]，因此我们希望在玉米中表达GO基因，通过H2O2的产生来诱导植物的防御反应以提高植物的抗病性。本研究采用花粉管通道法，用葡萄糖氧化酶基因转化玉米，目的是获得抗玉米大斑病的植株，同时优化转化影响因子，建立高效、易重复的玉米遗传转化系统，拓宽玉米抗病基因资源，为玉米基因工程提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验共用4份玉米自交系：其中抗大斑病自交系1份（05-830）、感大斑病自交系3份（543、05-848、03-812），均由黑龙江省农业科学院玉米研究所提供。试验用双元质粒载体pGBIGO含有人工合成的葡萄糖氧化酶基因（GO）、NPTⅡ基因，这两个基因分别带有胭脂碱合成酶的NOS启动子和花椰菜花叶病毒的35S启动子（见图1）。

图1 pGBIGO质粒Fig.1 pGBIGO plasmid

1.2 方法

1.2.1 质粒DNA提取

采用碱裂解法[13]，提取后在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳，分析其纯度和浓度。

1.2.2 导入基本操作方法

在玉米刚刚要抽出花丝的时候，将雌穗套袋，待花丝抽出10～15 cm时，进行人工授粉，记录授粉时间，授粉后12～36 h剪去雌穗顶端多余的苞叶。从花丝顶端2～3 cm处剪齐，中间用手术刀将花丝去除，挖出1个由苞叶围成的小穴，用5 mL注射器将质粒DNA溶液注入小穴，滴注大约500～1 000 μL，使花丝完全浸润在DNA溶液中，待溶液被吸收后，重复滴注一次。记载导入时间和质粒的浓度等。操作在晴天的上午进行。转化后1周，检查雌穗生长情况，去除污染物，秋后按株穗为单位收获D0代种子。

1.2.3 不同浓度DNA溶液对结实率的影响

配制4个浓度的质粒DNA（0、50、100、200 μg·L-1），在授粉后20 h分别转化自交系543、05-848、03-812，收获时按不同的组合统计结实率。

1.2.4 不同浓度DNA和转化时期对转化效率的影响

配制3个浓度的质粒DNA（50、100、200μg·L-1）以及5个导入时间（分别为授粉后5、10、15、20和25 h），分别转化自交系543、05-848、03-812，共27个处理，每个处理操作10个雌穗。收获的转化籽粒用400 mg·L-1的卡那霉素溶液浸泡24 h后分批分次播种于温室花盆中[14]。出苗后每隔一周用400 mg·L-1的卡那霉素水溶液进行喷浇，可看到一部分苗出现白化现象。计算转化率（%）=D0代卡那霉素抗性株数/总株数×100%。

1.2.5 转基因植株的检测

卡那霉素检测：转化D0籽粒用400 mg·mL-1的卡那霉素溶液浸泡20 h后种植，卡那霉素抗性正常苗在3叶期继续涂抹卡那霉素溶液，抗性植株无变色反应，仍然持绿。初步计算转化率。

PCR检测：对D0代卡那霉素抗性植株用CTAB法提取的叶片总DNA作模板，以GO基因编码区两端的部分序列（Primer 1∶5'AGCAGTGTGGAA GGCAAGCAG 3'，Primer 2∶5'CTGACCTTGTCACCT CTCAG 3'）为引物，反应体系为94℃预变性，2 min，94℃变性，10 s，60℃退火，30 s，70℃延伸1 min，30次循环，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。计算转化率。

1.2.6 大斑病抗性测定

接种方法：将上年秋季采集的玉米大斑病病叶粉碎浸泡24 h，选择空气湿度较大的傍晚将湿碎叶撒在玉米心叶内，接菌2次，人工接菌在玉米拔节后和抽雄前期进行。

病情调查分级标准参照孙海潮等的玉米大斑病鉴定标准进行田间调查[8]。1级：全株叶片无病斑或仅在穗位下部叶片上有零星病斑，病斑占叶面积少于5%；3级：穗位下部叶片上有少量病斑，占总面积的6%～10%，穗位上部叶片有零星病斑；5级：穗位下部叶片上病斑较多，占总面积的11%～30%，穗位上部叶片有少量病斑；7级：穗位下部叶片或穗位上部叶片有大量病斑，病斑相连，占总面积的31%～70%；9级：全株叶片基本为病斑覆盖，叶片枯死。其中，1级为高抗（HR），3级为抗病（R），5级为中抗（MR），7级为感病（S），9级为高感（HS）。

以抗病自交系05-830为抗病绝对对照，未转化自交系植株作相对对照，进行转化植株叶片病斑数据统计，进行大斑病抗性分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度DNA溶液对结实率的影响

如表1所示，随着DNA浓度加大，雌穗结实率呈下降趋势，从32.1粒·穗-1（DNA浓度为0 μg·mL-1）下降到10.8粒·穗-1（DNA浓度为200 μg·mL-1）。很多穗或籽粒由于DNA的导入发育不良或发霉无法收获，仅收获了近50%的穗数。因此，应采取一定的对策来提高结实率。在导入转化1周后，检查雌穗发育状况，及时去除发育停滞的雌穗；尽量在保证转化的前提下，减少导入DNA溶液的体积；另外转化操作尽量在上午湿度在85%以上的晴朗天气进行，防止DNA溶液蒸发过快。

表1 不同自交系及DNA浓度对结实率的影响Table 1 Effect of different inbred lines and DNA concentration on seed-set

2.2 DNA浓度与转化时期对转化效率的影响

DNA浓度大小影响DNA的运输速度，授粉时间长则花粉管通道已经闭合、授粉时间短则花粉管通道尚未形成，均影响DNA到达胚性细胞，进而影响转化。由表2可以看出，授粉后10 h外缘DNA就可以整合到受体基因组，但转化频率较低（0.04%），授粉后15 h获得了最高的转化率（1.17%），在以后的时间内转化率逐渐下降，对所设置的处理研究发现，花粉管通道法介导转化玉米，基因型间转化率无差异，最适合的转化DNA浓度为100 μg·mL-1。在授粉后15 h转化率最高，随后转化率逐渐下降。本试验优化的转化条件为人工自交授粉后15 h为最佳导入时间，所用DNA浓度为 100 μg·mL-1。

表2 DNA浓度和转化时期对转化率的影响Table 2 Effect of DNA concentration and transformation duration on transformation frequency

2.3 转化体的卡那霉素抗性检测

三种自交系共转化雌穗200个，获得3 276个籽粒，将这些用卡那霉素溶液（400 mg·L-1）浸种后出苗2 043株，其中白化株为1 013株，三叶期通过卡那霉素涂抹进行抗性筛选，获得244个D0代卡那霉素抗性植株（包括1/2叶片持绿株）。

2.4 PCR检测结果

PCR方法可以方便地从大量的后代植株中筛选出少数的目标转化植株，使筛选简便、快捷、经济。将初步卡那霉素抗性筛选阳性的D0代提取叶片总DNA，对其进行PCR检测。本试验设计了一套简化的复合分组筛选策略，简化玉米叶片模板DNA分离方法，提取时间缩短至5 min。具体的筛选策略为：以组合为单位，从D0代的幼嫩转基因植株上取半片小叶，分别提取总DNA后，以10株为1个单位混合总DNA进行PCR扩增，发现阳性扩增片断后，再分别检测该组合内的10个植株，使检测效率提高了10倍以上。如图2所示，本试验结果获得13株PCR阳性植株。其中5株543、4株05-848和4株03-812。

图2 D0代玉米植株的PCR检测Fig.2 PCR analysis of maize D0plants

2.5 转化植株的抗病性筛选

根据孙海潮报道的抗病性筛选方法[8]，统计了13个PCR阳性植株在田间自然发病情况下的玉米大斑病抗病性情况，结果见表3。4个植株抗病性未增强（D3、D7、D10、D13），6个植株抗病性有所改善，其中3株（D2、D4、D8）为高抗。选择抗病性稳定植株需要在基本抗病株自交后代中继续接种鉴定进行，这部分工作正在进行中。

表3 PCR阳性植株的田间抗病性鉴定Table 3 Disease resistance certification of PCR-positive plants in field

3 讨论与结论

由于抗病材料和抗性遗传研究缺乏，限制了玉米抗病育种技术的发展。本研究所用抗病对照05-830虽然大斑病抗性较好，但籽粒小、多分蘖，通过常规育种改造困难。本研究通过转基因技术转化一般配合力较好、抗病性差的自交系，提高抗病性，为培育实用抗病玉米自交系提供了一个新途径。本研究中卡那霉素抗性筛选与PCR的检测存在一定的差异，主要原因是花粉管通道转化方法在一定程度上影响了玉米转化籽粒发育，因此D0代植株生长及基因表达存在差异，因而卡那霉素抗性表达存在差异。在进行D0代植株的卡那霉素抗性筛选时应采用相对较低的浓度。在检测的过程中，由于转化籽粒多，本研究则根据田间植株的生长差异结合卡那霉素抗性筛选的结果进行分子检测，在一定程度上，既减少了工作量，又防止了转化基因植株漏检。另外，本试验采用复合分组PCR的检测方法在很大程度上减少了工作量，作者认为该方法非常适用于花粉管通道法转化后代的检测。

花粉管通道法转化外源总DNA技术己经在棉花、水稻、大豆、小麦及玉米等多种作物中获得了成功[17-21]。与农杆菌介导法、基因枪法等转化方法相比，花粉管通道法转化省去了其他转化方法的组织培养过程，具有简便、效率高和可操作性强等特点。本研究将该方法用于转化葡萄糖氧化酶抗病基因，取得了理想的效果。花粉管通道法转化关键是确定适宜的导入时间，利于外源DNA的进入和整合。导入充分考虑温度、湿度等气象因子，同时结合不同受体材料的受精发育特点，本试验确定授粉后15～20 h为最佳导入时间段。本试验用该方法转化，通过检测，部分转化后代提高了大斑病抗性，为玉米抗病育种提供了一个新途径。

*邸宏为本文的同等贡献者。

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