中药髓复康对恒河猴急性脊髓损伤后脊髓组织勿动蛋白-A表达的影响

何爽，张万强，朱嘉，孔焕宇

实验研究

中药髓复康对恒河猴急性脊髓损伤后脊髓组织勿动蛋白-A表达的影响

何爽1，张万强2，朱嘉2，孔焕宇2

目的：观察急性脊髓损伤后中药髓复康干预对脊髓组织勿动蛋白-A表达的影响。方法：成年雄性恒河猴14只，其中10只用于制备T12胸髓左侧半横断损伤模型，并将其随机分为髓复康组和模型组，另外4只设为正常对照组。观察评估恒河猴脊髓神经功能恢复情况，采用原位杂交法及免疫组化法检测各组Nogo-A的表达量。结果：给药30 d后，髓复康组患肢神经功能恢复优于模型组；脊髓损伤后Nogo-AmRNA及其蛋白的阳性细胞数及其阳性产物的OD值均明显升高，与正常组比较差异显著（P<0.05）；其中髓复康组Nogo-AmRNA及其蛋白的阳性细胞数和其阳性产物的OD值都明显低于模型组。结论：中药髓复康对脊髓损伤后恒河猴脊髓中Nogo-A的表达有一定的抑制作用，为神经的修复和再生提供有利的微环境，促进了脊髓损伤后恒河猴运动神经功能的恢复。

中草药；脊髓损伤；恒河猴；Nogo-A

近年来研究发现中枢神经系统(central nervesystem,CNS)微环境中存在神经元轴突再生抑制因子，是导致成年哺乳动物CNS缺乏自我再生和修复能力的原因之一。勿动蛋白-A（Nogo-A）是CNS损伤后抑制轴突再生的重要因子，本实验通过建立脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）模型，对各组动物损伤后肢运动功能进行评诂；采用原位杂交及免疫组化的方法观察髓复康对急性脊髓损伤后Nogo-A表达变化的影响，以探讨髓复康对CNS神经轴突再生所起的作用。

1 材料和方法

1.1 药物与试剂中药髓复康（SFK）由生黄芪、川芎、赤芍、银杏叶、灯盏花、红花、葛根和三七等8味中药草药组成，水煎，生药浓度为2.5 g/mL；Nogo-A原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物有限公司，Nogo-A一抗购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 模型制备和分组成年雄性恒河猴14只(购自军事医学科学院，合格证号：0019631)，6 500～7 500 g,随机分为3组，正常组，4只；模型组，5只；髓复康组5只。后两组采用双盲法复制脊髓T12右侧半横断损伤模型[1]。

1.3 给药方法术后髓复康组灌喂髓复康水煎液，1次/d，共30 d，每次生药剂量为8.55 g/kg。第1次喂药在麻醉清醒后4 h以内，其余两组恒河猴按髓复康组方式灌喂等量的生理盐水。

1.4 取材和切片于术后30 d，在5%戊巴比妥钠（0.1 mL/kg）配合速眠新（0.1 mL/kg）麻醉下，经左心室升主动脉插管，依次用生理盐水和4%多聚甲醛PBS溶液灌注固定。以半横断损伤区为中心，取出长1c m的脊髓组织，投入4%多聚甲醛内继续固定24 h。按常规制备脊髓损伤区的石蜡冠状切片，切片厚5μm，连续切片，每隔5张取1张，每只动物取3张切片。

1.5 行为学观察观察术后1、7、14、21、30 d右后肢自主运动、肌力的变化，根据文献[2-3]对肌力进行评价,将肌力分为6级，最低为0级，最高为5级属正常。

1.6 脊髓组织原位杂交检测Nogo-A寡核苷酸探针序列为：

①5’—GCTCT TCCTG CTGCA TCTGA GCCTG TGATA—3’

②5’—TTCAG AATTA GAATA CTCAG AAATG GGATC—3’

③5’—GCAGA TAGAT CATTA TCTAG GACTT GCAAA—3’

以地高辛标记法，按说明书进行操作，常规脱水、透明、封片。

1.7 脊髓组织免疫组化染色方法参照试剂盒说明书，DAB显色。

1.8 图像分析脊髓切片上随机选取8个不同视野，用Image Pro Plus程序对采集的图像进行半定量分析，测定Nogo-A的阳性细胞数和其阳性表达物的平均光密度值（OD）。以8个视野的均值作为评价该样本Nogo-A阳性表达的数值。

1.9 统计学处理应用SPSS 12.0统计软件，所得数据用±s)表示，进行单因素方差分析和q检验，显著水平为P﹤0.05。

2 结果

2.1 动物行为学观察术后1 d，各损伤组右下肢肌力为0级，均表现为完全瘫痪，对针刺无反应。术后7 d，模型组无明显好转；髓复康组患肢对刺激有反应，肌力可达到1级。术后14～21 d，模型组患肢肌萎缩明显，肌力基本达到1级；髓复康组患肢开始出现自主活动，可以部分负重，多数患肢达到3级。术后30 d，模型组多数肌力接近2级，小关节无明显活动；髓复康组有3只患肢肌力可达到4级，能主动握持，可行走。另外2只肌力也达到3级水平。正常组动物身体良好（见表1）。

表1 各组恒河猴各时间点肌力评分(s)

表1 各组恒河猴各时间点肌力评分(s)

注：与正常组比较，＊＊P<0.01；与模型组比较，△△P<0.01

组别正常组模型组髓复康组n4 5 5 1 d 5.00±0.00 0.00±0.00＊＊0.00±0.00＊＊7 d 5.00±0.00 0.00±0.00＊＊0.80±0.45＊＊△△14 d 5.00±0.00 0.60±0.55＊＊1.60±0.55＊＊△△21 d 5.00±0.00 1.00±0.00＊＊2.60±0.55＊＊△△30 d 5.00±0.00 1.60±0.55＊＊3.60±0.55＊＊△△

2.2 脊髓组织Nogo-AmRNA原位杂交结果Nogo-A mRNA阳性细胞胞浆呈棕黄色，胞核无色（图1）。脊髓损伤后各手术组Nogo-A mRNA阳性细胞计数明显增多，OD值明显升高，其中髓复康组（图2）阳性细胞数及OD值明显低于模型组（图3），差异有显著性(P＜0.05）（见表2）。

2.3Nogo-A免疫组化结果Nogo-A免疫反应产物主要在胞浆，脊髓损伤后模型组（图4）Nogo-A阳性细胞数明显增多，OD值明显升高，与正常组（图5）比较差异明显；髓复康组（图6）Nogo-A表达明显下降，与模型组相比呈显著差异（P＜0.01)（见表3）。

3 讨论

成年哺乳动物CNS再生困难的主要因素之一，就是CNS内环境限制了轴突再生,这种限制作用与髓鞘产生的神经生长抑制因子有关。目前,人们已经在CNS髓磷脂中分离出了多种抑制神经再生的因子,其中Nogo蛋白(勿动蛋白)是最重要的因子之一，在CNS神经纤维的再生修复中起重要作用[4]。

表2 Nogo-A mRNA阳性细胞计数和平均光密度(±s)

表2 Nogo-A mRNA阳性细胞计数和平均光密度(±s)

注：与正常组比较，＊P<0.05,＊＊P<0.01；与模型组比较，△P<0.01

组别正常组模型组髓复康组n4 5 5细胞计数（个）11.00±1.58 29.80±3.89＊＊15.60±1.67＊△平均光密度（OD）0.207 4±0.006 8 0.272 3±0.008 5＊＊0.253 0±0.008 2＊＊△

表3 Nogo-A免疫组化阳性细胞计数和平均光密度±s)

表3 Nogo-A免疫组化阳性细胞计数和平均光密度±s)

注：与正常组比较，＊P<0.05,＊＊P<0.01；与模型组比较，△△P<0.01

组别正常组模型组髓复康组平均光密度（OD）0.199 6±0.008 5 0.275 6±0.019 5＊＊0.233 7±0.013 9＊△△n4 5 5细胞计数（个）12.2±3.11 27.8±2.39＊23.6±1.14＊△△

图1 正常组Nogo-A 20×原位杂交染色

图2 髓复康组Nogo-A 20×原位杂交染色

图3 模型组Nogo-A 20×原位杂交染色

图4 模型组Nogo-A20×免疫组化染色

图5 正常组Nogo-A 20×免疫组化染色

图6 髓复康组Nogo-A 20×免疫组化染色

2000 年，抑制CNS轴突再生蛋白Nogo的基因，相继被美国、英国、瑞士的3个实验室成功鉴定和克隆[5-7]，为中枢神经轴突再生的研究带来了新的希望。Nogo基因编码的蛋白称Nogo蛋白，Nogo蛋白包括3个不同的Nogo异构体[6],即NogoA、Nogo B和Nogo C,其中Nogo-A最长、具有最强的轴突生长抑制活性,在成年哺乳动物CNS具有抑制轴突生长锥的生长和再生的能力。NogoA主要位于CNS髓鞘中，在少突胶质细胞中表达。

本实验检测脊髓损伤恒河猴Nogo-AmRNA及Nogo-A蛋白表达变化，结果发现：Nogo-A在正常恒河猴脊髓中有所表达，脊髓损伤后，Nogo-AmRNA及Nogo-A蛋白表达明显上调，但髓复康组Nogo-AmRNA及Nogo-A蛋白表达与模型组比较均明显下调，两组比较差异显著（P＜0.01）。说明SCI后，细胞随即作出相应蛋白重组反应，启动抑制机制，阻止神经纤维的修复和再生；应用髓复康后，在一定程度上抑制了Nogo-AmRNA的表达，进而导致Nogo-A蛋白合成减少，以适应神经轴突再生的需要。

现代中医认为，急性脊髓损伤是因为暴力伤及督脉，其基本病理变化是瘀血阻络。筋脉肌肉失去气血之温煦濡养，则见肢体麻木，感觉运动障碍。方中黄芪补气升阳，培补后天，强壮肌肉四肢，为君药；川芎、赤芍、银杏叶、灯盏花、红花和三七等共奏活血化瘀，舒筋活络之效，共为臣药；葛根升举阳气，益胃生津可助黄芪强壮肌肉，培补后天，为佐药；川芎“上行头目，下行血海”为引经之药，引药直达病所，使气血流畅，督脉、宗筋得以濡养。全方共具强筋骨，壮腰膝，健督脉之功用。

本实验结果提示，在SCI早期应用髓复康治疗，对运动功能的恢复有良好的促进作用。其机制之一可能是通过抑制Nogo-A表达，减轻其对轴突生长的抑制作用。SFK的这种作用及其所创造的微环境将有利于神经纤维的修复和再生，从而促进脊髓损伤所造成的神经功能障碍的恢复，但是这一机制尚需进一步研究。

[1]胥少汀,郭世绂.脊髓损伤基础与临床[M[.第2版.北京:人民卫生出版社,2002:298.

[2]Tator CH.Acute spinal cord injury in primates producted by an in⁃flatable extrdural cuff[J].Can J Surg,1973,16(3):222.

[3]孟晓梅,游思维,林英华,等.脊髓半切后胫后神经体感诱发电位与后肢运动功能的相关性研究[J].中华创伤杂志,2002，18(3):144.

[4]JiB,LiM,Budel S,et al.Effect of combined treatment with methyl⁃prednisolone and soluble Nogo-66 receptor after rat spinal cord in⁃jury[J].Eur J Neurosci,2005,22(3):587.

[5]ChenMS,HuberAB,van derHaar ME,et al.Nogo-A is a my⁃elin-associated neurite outgrowth inhibitor and an antigen for monoclonal antibody IN-1[J].Nature,2000,403（6768）:434.

[6]Prinjha R,Moore SE,Vinson M,et al.Inhibitor of neurite out⁃growth inhumans[J].Nature,2000,403(6768):383.

[7]GrandPre T,Nakamura F,Vartanian T,et al.Identification of the Nogo inhibitor of axon regeneration as a Reticulon protein[J].Na⁃ture,2000,403(6768):439.

（收稿：2010-01-06修回：2010-06-20）

（责任编辑刘洪斌田在善）

Effect of Chinese Herbal Medicine Suifukang(髓复康)on Expressin of Nogo-A Following Spinal Cord Injury in Rhesus Monkeys

He Shuang,Zhang Wanqiang,Zhu Jia,et al.The Special Educational College,

Changchun University,Changchun(130022),China

ObjectiveTo investigate the effects of Chinese Herbal Medicine Suifukang(SFK)(髓复康)on the changes of the functional recovery and the expression of Nogo-A following spinal cord injury in rhesus mon⁃keys.MethodsThere were fourteen adult rhesus monkeys and ten of them

left spinal cord hemisec⁃tion at T12,and then randomly divided into two groups:SFK group(5)and control group(5).The other 4 mon⁃keys remained in the normal group.The expression of Nogo-A mRNA was detected by in-situ hybridization and the expression of Nogo-A protein was detected by immunohistochemistry.ResultsThe functional recovery of the nerve of the affected limb in the SFK group was better than that in the model group;The positive cells of No⁃go-A mRNA and its OD value in the model group were more than in other groups(P<0.05);The Nogo-A mRNA positive cells and its OD value in SFK group were more than those in normal group(P<0.05).The chang⁃es of Nogo-A protein positive cells number and its OD value were similar to those of Nogo-A mRNA. ConclusionSFK can restrain the expression of Nogo-A obviously.It is possible to improve the microenviron⁃ment in the injured spinal cord for regeneration of nervous tissue,and facilitate the movement ability of injured spinal cord in rhesus monkeys.

Chinese herbal medicine,spinal cord injury,rhesus monkey,Nogo-A,SFK

R285.5

A

1007-6948(2010)05-0551-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2010.05.012

本课题受国家自然科学基金资助（30572304）

1．长春大学特殊教育学院针推系（长春130022）

2．中国中医科学院望京医院

孔焕宇，Tel：010-64014411-2572；E-mail：konghy55@ 163.com