川芎嗪对热应激所致猪睾丸细胞内活性氧水平的影响

张晓峰,刘 迪,李 垚

(1.东北农业大学动物科学技术学院,黑龙江 哈尔滨 150030;2.哈尔滨医科大学公共卫生学院,黑龙江 哈尔滨 150081)

由于畜禽饲养密度相对过大,使饲养环境温度升高,由此导致的动物热应激(heat stress)给养殖业造成了较大的经济损失。热应激对动物繁殖性能的负面影响引起了国内外学者的广泛关注,但热应激对畜禽繁殖性能不良影响的机理尚不十分清楚。川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)是从川芎的干燥根茎中提取的一种生物碱单体,其化学结构为4-甲基吡嗪,具有抗血小板聚集、扩张血管、保护血管内皮、改善微循环等多种药理作用,用于部分心脑血管等疾病的治疗并取得良好疗效[1];TMP同时还具有抗氧化、抑制和清除自由基产生、提高内源性超氧化物歧化酶活性等生物作用,但其作用机制尚未阐明[2]。正常生理情况下,体内自由基产生和清除处于动态平衡状态,当动物受到应激时,会使自由基产生增加,而自由基清除体系能力不足,造成体内自由基蓄积,导致组织氧化损伤。本研究以猪睾丸细胞为研究对象,以活性氧(reactive oxygen species,ROS)为着眼点,探讨TMP对热应激所致细胞氧化损伤的拮抗作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 川芎嗪购自南京泽朗医药科技有限公司,纯度98%,白色针状结晶,溶于60°C热水中;MEM培养基购自美国Invitrogen公司;小牛血清购自上海纬群生物技术有限公司;EDTA/胰酶和MT T购自美国Sigma公司;活性氧检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所;流式细胞仪(Beckman,美国);电热鼓风干燥箱(泰斯特,中国)。

1.2 细胞培养 猪睾丸(ST)细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所王永博士惠赠。细胞在37°C、5%CO2条件下培养于含 10%小牛血清的MEM培养基中,EDTA/胰酶消化、传代,取对数生长期细胞用于试验。

1.3 细胞分组与处理 试验设热应激组、TMP组、热应激+TMP组、阴性对照组。热应激组细胞置于电热干燥箱中43°C恒温烘烤;热应激+TMP组细胞先加入TMP预培养12 h后,再43°C恒温烘烤;TMP组细胞试验结束前12 h加入TMP;阴性对照组细胞不做任何处理。

1.4 细胞毒性检测(MT T分析法) 将细胞接种于96孔培养板(1×104/孔),培养24 h后按上述方法处理细胞,另设阴性对照组和空白对照组,每组6个重复孔。培养结束前4 h加入MT T(5 mg/mL,20μL/孔),培养结束后弃去液体 ,加入DMSO(150μL/孔)震荡混匀,于酶标仪490 nm波长测定吸光度(OD)值,计算抑制率。

1.5 细胞活性氧检测 按试剂盒说明书操作。2×104细胞接种于细胞培养瓶中,按上述方法处理细胞后,采用原位装载探针的方法,加入DCFH-DA(终浓度 3.3 μ mol/L)37°C 孵育 20 min,用无血清细胞培养液洗涤细胞3次,收集细胞悬浮于PBS中流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 热应激及TMP细胞毒性作用 在本试验条件下,热应激、TMP及两者联合作用细胞后,均未见明显的细胞毒性作用,试验结果见图1。

2.2 热应激及TMP对细胞内活性氧水平影响43℃作用细胞1 h,细胞内ROS水平与对照组比较未见明显升高(P＞0.05),但43℃作用2 h细胞内ROS水平显著升高(P＜0.05)。160μg/mL和320μg/mL TMP能显著抑制热应激所致细胞内 ROS水平的升高,结果见图2。

3 讨论

ROS是指含氧的自由基,是细胞氧化磷酸化过程氧的代谢副产物,是一类有高度化学反应活性的含氧基团,包括羟自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(O-2·)、单线态氧(O2)及过氧化氢(H2O2)等[3]。ROS容易与生物大分子发生反应,导致细胞结构的破坏,影响机体正常细胞和组织的功能,从而引起多种疾病。过量ROS生成时会对生殖细胞产生损伤作用,攻击细胞膜及脂蛋白中的多元不饱和脂肪酸,导致细胞膜流动性下降和脂质过氧化、蛋白质和DNA破坏或参与诱导生殖细胞发生凋亡,从而直接和间接影响畜禽的繁殖功能[4-5]。有研究表明,ROS与精子畸形率有极密切的关系,ROS产生过量过多时,形态异常以及活动性差的精子数量则会增多[6]。本研究结果表明,热应激作用细胞1 h,细胞内ROS水平未发生显著变化,但作用细胞2 h,细胞内ROS水平显著升高,提示热应激能诱发睾丸细胞内ROS生成,进而可能会影响睾丸细胞的生精功能。在脱离热应激源后,随着时间延长,睾丸细胞内ROS水平如何变化,我们将在以后的研究中进一步探讨。另外,在本研究中,我们观察了TMP对细胞氧化损伤的保护作用,结果表明 TMP能显著抑制热应激所致的细胞内ROS的产生,具有剂量-效应关系,进一步证明了TMP具有抗氧化、抑制自由基的作用,同时也为探寻抗热应激剂提供了研发方向。我们曾试图检测细胞培养液中参与机体氧化和抗氧化反应的酶的变化,但由于试验方法检测灵敏度的限制,而没有成功。

综上所述,热应激能使睾丸细胞内活性氧生成增加,诱发氧化损伤,川芎嗪能显著抑制热应激所致的睾丸细胞内活性氧的生成,具有抗氧化损伤作用。

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