子宫内膜炎奶牛子宫中几种因子的变化

赵树臣,张冬波,侯振中

(东北农业大学动物医学学院,黑龙江 哈尔滨 150030)

奶牛子宫内膜炎是奶牛的常发疾病,它可推迟繁殖计划和降低产奶量,造成巨大的经济损失。由于炎症的发生,其炎性产物和细菌毒素对子宫黏膜的损害,引起子宫黏膜的炎症病理变化,这其中有大量的细胞因子参与,同时会产生大量的自由基。子宫炎症细胞产生的大量氧自由基有抑菌、杀菌作用,可防止病原体的进一步侵袭。但氧自由基过度聚集却能降低子宫的免疫细胞功能。因而进行本试验为了阐明发生子宫内膜炎后子宫内抗氧化系统和细胞因子间的变化情况,探讨子宫内膜炎的发病机理。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 723型可见光分光光度计、FJ-2008P全自动放射性计数仪、电子天平、冰箱、恒温水浴箱、旋涡混匀器、组织匀浆器等。SOD、GSHPx、MDA、NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所,IL-2、IL-6、IL-8及 TNF-α放免试剂盒购自北京科美东雅生物技术有限公司。

1.2 样本采集与制备 在哈尔宾市一大型屠宰厂收集临床处于间情期的淘汰奶牛子宫样品85例,年龄5～9岁。屠宰后立即采取奶牛生殖器官,观察子宫颈口、子宫内分泌物,颜色、性状等情况。按照Dohmen M等[1]建立的子宫内膜炎分类标准,将其分为3组,A组(有黏液和脓液,但脓液少于一半)25例;B组(内含大量脓液,且呈黄褐色,有充血)21例;C组(出血、坏死严重,有腐臭味)20例,患子宫内膜炎奶牛标本66例。对照组为正常子宫样品19例。

取子宫内膜组织块(0.2～1.0 g)用冷生理盐水冲洗血液,滤纸吸干,电子天平称重后制成10%匀浆液,低温离心机4000 r/min离心 15 min,取上清液,进行各指标的测定。

1.3 子宫匀浆中SOD、GSH-Px、MDA、NO 的测定

采用分光光度法,按试剂盒规定方法测定,并按所给公式计算测定结果。

1.4 子宫匀浆中细胞因子 IL-2、IL-6、IL-8及TNF-α的测定 采用放射免疫分析法。标准曲线以Log(B/B0%)为纵坐标,以标准品浓度的 Log(C)为横坐标,在Logit-Log坐标纸上绘制Log(B/B0%)=A+B Log(C)一次函数标准曲线,根据样品B/B0%,从标准曲线求出样品的含量。B/B0%=

2 试验结果

2.1 子宫匀浆中 SOD、GSH-Px、MDA、NO 含量() 见表 1。

表1 子宫匀浆中 S OD、GSH-Px、MDA、NO 含量 ()

表1 子宫匀浆中 S OD、GSH-Px、MDA、NO 含量 ()

a:显著性差异,P＜0.05;b:极显著性差异,P＜0.01

组别 例数 SOD(U/mgprot) GSH-Px(U/mgprot) MDA(nmol/mgprot) NO(nmol/mgprot)A 组 25 52.158±7.496 86.928±6.890 0.501±0.095a 0.444±0.117 B组 21 37.480±4.606a 84.511±11.775 0.736±0.111b 0.639±0.133a C组 20 36.048±3.796a 51.281±7.297b 1.055±0.373b 1.246±0.350b对照组 19 49.119±5.340 90.778±9.018 0.293±0.078 0.367±0.095

2.2 IL-2、IL-6 、IL-8、TNF-α标准曲线 IL-2 标准曲线:Log(B/B0%)=0.83-0.02 Log(C),R=0.9992;IL-6标准曲线:Log(B/B0%)=5.02-0.76 Log(C),R=0.9971;IL-8标准曲线:Log(B/B0%)=0.87A-0.18 Log(C),R=0.9958;TNF-α标准曲线:Log(B/B0%)=1.17-0.83 Log(C),R=0.9999。

2.3 子宫匀浆中 IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α的含量见表2。

3 讨论

IL-2主要由Th1细胞产生,具有广谱免疫增强活性,可诱导 T细胞增殖,诱导NK细胞和LAK细胞产生IFN-γ、TNF-α等细胞因子,活化巨噬细胞[2]。本试验结果显示,与对照组比较,A组、B组、C组IL-2含量极显著性增高(P＜0.01)。但患子宫内膜炎A、B、C 3组炎症愈严重,IL-2水平愈显下降,可能原因是:一方面是因为患子宫内膜炎奶牛免疫功能障碍,Th1水平低致IL-2分泌下降;另一方面,感染激活了T细胞、B细胞和巨噬细胞,进而表达并释放IL-2R增加,消耗了大量的IL-2,IL-2水平下降。IL-6主要是由巨噬细胞、T细胞、B细胞等多种细胞产生的一种糖蛋白,是炎症细胞因子网络中的关键成分,与感染性疾病的发生、发展密切相关[3]。Ishikawa Y等[4]报道,生产乳牛外周血液中产前IL-6含量普遍高于产后,产前IL-6水平过高,预示乳牛产后易患子宫内膜炎。本试验结果显示,与对照组比较,A组、B组IL-6含量极显著性增高(P＜0.01),C组IL-6含量显著性增高(P＜0.05)。说明组织中高表达的IL-6有助于局部炎症的发展。IL-8是一种中性粒细胞、T细胞以及嗜碱性粒细胞的趋化因子,它能提高嗜中性粒细胞在炎症部位的结合能力,从而增强白细胞的粘附和移行,还可造成多种炎症介质的释放,在炎症反应中起重要作用。本试验结果显示,与对照组比较,B组IL-8含量极显著性增高(P＜0.01),A组、C组IL-8含量显著性增高(P＜0.05),可能是当患有奶牛子宫内膜炎时,病原微生物刺激子宫系统中多种细胞释放各种细胞因子,这些细胞因子能刺激子宫内膜中的内皮细胞、单核-吞噬细胞等分泌 IL-8。TNF亦是一种细胞因子,可提高粒细胞的吞噬能力,Fumuso E等[5]报道,在易患产后子宫内膜炎和对产后繁殖疾病抵抗力强的母马子宫活组织检查中发现TNF-αmRNA前者与后者相比呈高度表达。本试验结果显示,与对照组比较,A组 TNF-α含量差异不显著,B组TNF-α含量显著性增高(P＜0.05),C组TNF-α含量极显著性增高(P＜0.01)。

表2 各组中子宫内膜IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α的含量()

表2 各组中子宫内膜IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α的含量()

a:差异显著,P＜0.05;b:差异极显著,P＜0.01

组别 例数 IL-2(ng/mL) IL-6(ng/mL) IL-8(ng/mL) TNF-α(ng/mL)A 组 25 0.941±0.289b 0.372±0.071b 0.085±0.007a 0.549±0.103 B组 21 0.572±0.093b 0.427±0.083b 0.100±0.016b 0.739±0.136b C组 20 0.409±0.273b 0.323±0.111a 0.075±0.007a 0.648±0.123a对照组 19 0.278±0.142 0.229±0.034 0.067±0.007 0.424±0.135

自由基(free radical,FR)己成为生物学中一个十分活跃的研究领域,目前的研究表明,自由基介入绝大多数疾病的病理过程。由本试验结果可知,与对照组比较,A组、B组GSH-Px活力差异不显著,C组GSH-Px活力极显著性降低(P＜0.01);与对照组比较,A组SOD活力变化差异不显著,B组、C组SOD活力显著性降低(P＜0.05)。表明奶牛子宫局部的抗氧化酶随着奶牛子宫内膜炎症的加剧,子宫内膜组织中其活性降低,相应的子宫内膜组织中的MDA含量逐渐增高,抗氧化能力降低。与对照组比较,A组MDA含量显著性增高(P＜0.05),B组、C组MDA含量极显著性增高(P＜0.01)。国外学者[6]报道,患子宫内膜炎的阿拉伯纯种母马的血浆和红细胞中MDA含量显著增加,而GSH-Px活性显著下降,认为自由基在子宫内膜炎病中起这重要作用,GSH-Px活性的降低是由于强大的脂质过氧化反应引起的,和本研究结果相一致。与对照组比较,A组NO含量差异不显著,B组NO含量显著性增高(P＜0.05),C组NO含量极显著性增高(P＜0.01),表明NO也参与该炎症过程,而且随着炎症程度的增加,其含量也增加。Alghamdi A S等[7]也曾报道,人工诱导的患子宫内膜炎的母马子宫分泌物中NO含量比正常者显著升高,活组织检查中NOS高度表达。

本结果初步表明,在子宫内膜炎发展过程中,各种细胞因子均有不同程度的升高,参与机体的炎症反应,同时氧自由基也参与了致病过程,这很可能是子宫内膜炎发病后的重要机制。

[1]Dohmen M,Lohuis J,Huszenicza G Y,et al.The Relationship between bacteriological and clinical finding in cows with subacute/chronic endometritis[J].Theriogenology,1995,43:1379-1388.

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