鸡传染性贫血病毒对鸡传染性囊病活疫苗(Gt株)免疫效果的影响

宇文延青,高玉龙,高宏雷,祁小乐,林 欢,王笑梅

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150001;2.河南师范大学生命科学学院,河南 新乡 453007)

鸡传染性贫血(CIA)是由鸡传染性贫血病毒(CAV)引起的一种以再生障碍性贫血和淋巴器官组织萎缩为主要特征的免疫抑制病。崔现兰(1992)首次于我国东北地区分离到该病毒[1],目前在我国许多地方都有该病毒的报道。CAV侵入雏鸡体内后,主要作用于骨髓和胸腺等淋巴器官,导致感染鸡出现再生障碍性贫血及胸腺等淋巴器官严重萎缩,产生免疫抑制,对禽病疫苗的免疫应答机能降低,甚至丧失。为研究鸡传染性囊病病毒对鸡传染性囊病活疫苗(Gt株)免疫效果的影响,本试验采用人工感染CAV的方法研究CAV感染对鸡传染性囊病活疫苗(Gt株)免疫效果的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 鸡传染性贫血病毒(M9905株)由本实验室分离鉴定保存;IBDV超强毒Gx株由本实验室保存,鸡传染性囊病活疫苗(Gt株)购自哈尔滨维科生物技术开发公司(批号:200724);鸡传染性囊病病毒抗体检测试剂盒购自IDEXX公司(批号:5040.00);1日龄SPF雏鸡由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供;基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司;PCR仪由 TaKaRa公司生产;TaKaRa Ex Taq DNA Polymerase为TaKaRa(大连)公司产品。

1.2 试验分组 将80羽1日龄白来航SPF雏鸡随机分为Gx株攻毒对照组(A)、CAV感染组(B)、Gt株免疫组(C)、CAV感染-Gt株免疫组(D)和阴性对照组(E),每组16羽,饲养于负压隔离器中。

1.3 攻毒与免疫接种 B组和D组在雏鸡1日龄时肌肉注射感染CAV-M9905,每羽0.1mL(雏鸡半数感染量CID50=94.5/0.2mL)。在雏鸡7日龄时,用鸡传染性囊病活疫苗(Gt株)口服免疫C组和D组,免疫剂量按说明书要求,同时,E组注射灭菌PBS。在雏鸡 28日龄时用 IBDV超强毒 Gx株(ELD50=102.72/0.1mL)对 A、B、C和D组攻毒,0.1mL/羽(10 ELD50),攻毒后连续观察1周,直至无死亡鸡出现为止,记录试验结果并计算。

1.4 引物设计 根据CAV-Cux-1株VP2基因(约650 bp序列(GenBank登录号:M55918),利用Oligo6.0软件设计1对引物,引物由上海英骏生物技术有限公司合成。上游引物CP1:5′-GCggatccATGCACGGGAACGGCGGAC-3′,下游引物 CP2:5′-CGGgtcgacTCACACTATACGTACCGG-3′(其中,小写字母为BamH Ⅰ和SalⅠ酶切位点)。

1.5 鸡传染性贫血病毒PCR检测 7日龄时每组随机抽取1羽雏鸡采集肝脏,研磨之,用试剂盒提取CAV基因组,进行PCR扩增并进行检测,PCR条件为:94℃4 min,94℃45 s,58℃45 s,72℃45 s,35个循环,72℃10 min,4℃保温。PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶检测。

1.6 血样采集与抗体检测 在雏鸡14、20、28日龄对C、D两组采血,每组5羽,按常规方法收集血清,用ELISA试剂盒对IBDV抗体进行检测。

2 结果

2.1 CAV感染后PCR检测结果 CAV感染后7 d,分别对各组随机抽样并进行 PCR检测,结果CAV感染组(B)和CAV感染-Gt株免疫组(D)均出现650 bp特异性条带,而Gx株攻毒对照组(A)和Gt株免疫组(C)均为阴性,表明B、D两组在人工感染后7 d均在肝脏检测到阳性信号,表明攻毒组有CAV的感染。

2.2 IBDV抗体检测结果 对C、D两组在14日龄、20日龄和28日龄采集的血清,用ELISA试剂盒对IBDV抗体进行检测并计算结果。见表1、图1。

表1 IBDV血清抗体检测

结果表明:鸡传染性贫血病毒感染1日龄雏鸡后导致免疫鸡传染性囊病活疫苗(Gt株)雏鸡抗IBDV血清抗体滴度上升较Gt株免疫组缓慢。

2.3 Gx株攻毒结果 28日龄时用IBDV超强毒Gx株对所有试验组攻毒,攻毒后连续观察1周,直至鸡无死亡为止,试验结果如表2。

表2 Gx株攻毒结果

结果表明:在28日龄攻 IBDV超强毒Gx株后,CAV感染组(B组)死亡率最高为83.4%,Gt株免疫组(D组)无死亡,CAV感染-Gt株免疫组(D组)死亡率为10%,阴性对照组死亡率为73.4%。

3 分析与讨论

自从崔现兰等人[1]1992年首次报道该病以来,广西、安徽、山东、河南、北京、河北、吉林等地也陆续报道了该病的流行。目前,该病在我国大部分地区存在并流行,由于CAV感染雏鸡致死率低(一般为10%～15%)、临床表现不明显,常常被养殖人员所忽视有关。研究表明,CAV感染后可引起雏鸡的免疫抑制导致鸡群对某些疫苗的免疫效力下降或者增强弱毒疫苗的致病力,从而导致免疫失败[2-4],给养禽业带来间接经济损失。近年来我国鸡IBD免疫失败常有发生,CAV的感染可能是一个不可忽视的重要因素。本试验通过CAV-M9905毒人工感染1日龄SPF雏鸡,7日龄免疫鸡传染性囊病活疫苗(Gt株),同时在14、21日龄和28日龄时采集雏鸡血清进行IBDV抗体效价检测,结果表明:CAV的早期感染除能造成雏鸡一定的死亡率外,还能造成耐过鸡对鸡传染性囊病疫苗(Gt株)免疫效力低下,导致抗体滴度上升缓慢,疫苗保护率下降,因此在加强IBDV的防控同时应加强CAV的监测。

[1]崔现兰,辜桂香.鸡传染性贫血病病毒的鉴定[J].中国畜禽传染病,1992,6:3-5.

[2]De Herdt P,van den Bosch G,Ducatelle R,et al.Epidemiology and significance of chicken infectious anemia virus infections in broilers and broiler parents under nonvaccinated European circumstances[J].Avian Dis,2001,45:706-708.

[3]Otaki Y,Nunoya T,Tajima M,etal.Enhanced pathogenicity of chicken anemia agent by infectious bursal disease virus relative to the occurrence of Marek′s disease vaccination breaks[J].Nippon Juigaku Zasshi,1989,51:849-852.

[4]von Bulow V,Rudolph R,Fuchs B.Enhanced pathenogicity of chicken anemia agent(CAA)in dual infections with Marek′s disease virus(MDV),infectious bursal disease virus(IBDV)or reticuloendotheliosis virus(REV)[J].Zentralbl Veterinarmed B,1986,33:93-116.