神经内分泌因子对新生犊牛肝细胞MTP mRNA丰度的影响

陈仕均,唐海蓉,刘兴友,刘开永

(1.河南科技学院实验中心,河南 新乡 453003;2.河南科技大学食品与生物工程学院,河南 洛阳 471003)

微粒体甘油三酯转运蛋白(M TP)是继载脂蛋白B(apoB)之后发现参与 TG转运及VLDL组装的内质网腔内蛋白,是一种重要的脂质转运蛋白。MTP主要作为载体在内质网腔与含脂蛋白的apoB等脂类结合以VLDL的形式转运出肝脏,对含脂蛋白的apoB装配和分泌起关键作用[1]。研究表明,MTP、apoB100、apoE和可溶性LDLR等蛋白质是肝脂转运的调节蛋白[2]。肝脏MTP的活性、基因表达状态是控制VLDL合成、装配和分泌速率的重要因素[3-4]。鼠肝 MTP mRNA过量表达导致肝VLDL分泌增加的研究表明,在正常状态下,MTP是肝VLDL组装和分泌过程的限制性因素[3]。MTP活性也可能是泌乳奶牛和严重脂肪肝奶牛VLDL的分泌速率的一个重要因子[2-4]。有关胰岛素、胰高血糖素,特别是瘦蛋白等神经内分泌因子对奶牛肝细胞 MTP基因表达的调节作用尚不太清楚。为此,本试验在原代培养的新生犊牛肝细胞培养液中添加胰岛素、胰高血糖素和瘦蛋白,应用已建立的半定量RT-PCR方法检测犊牛肝细胞中MTP mRNA丰度变化,为揭示这些神经内分泌因子调控奶牛肝VLDL组装与转运的分子机制,防制奶牛脂肪肝奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞原代培养,参照相关文献[6-7]进行。按每孔1×106个细胞接种于6孔板,每孔加入2mL分化培养基,于37℃,5%CO2培养箱中培养,4 h细胞完全贴壁后吸出培养基,加入2mL试验培养基,培养12 h后,在倒置显微镜下观察细胞生长情况,然后添加胰岛素、胰高血糖素和瘦蛋白继续培养24 h。

1.2 肝细胞MTP mRNA丰度的半定量RT-PCR检测 取接种于6孔培养板中培养12h生长良好的肝细胞,设5个不同浓度组(1为对照组,2～5为试验组),每组分别添加不同浓度的胰岛素(0、1、10、100 nmol/L 和 1000 nmol/L)、胰高血糖素(0、1、10、100 nmol/L 和1000 nmol/L)和瘦蛋白(0、2.5、5.0、10μg/L 和 50μg/L),每个浓度组设 3 个重复,培养24 h后,提取细胞总RNA。根据测定的RNA浓度调整总RNA的体积,使每个添加物中样品的RNA浓度相同。取相同浓度的RNA进行反转录反应合成cDNA,取相同量的cDNA按上述PCR体系和反应条件分别扩增MTP和β-actin基因目的片段。RT-PCR反应后产物进行琼脂糖凝胶电泳,电泳图片用凝胶成像分析软件计算密度(强度×面积)比例,进行统计学分析。

1.3 统计分析 应用SPSS 10.0软件对所得数据进行分析,差异显著性用ONE-WAY ANOVA方差分析,进行Duncan′s LSD检验。

2 结果

2.1 胰岛素对肝细胞MTP mRNA丰度的影响表1可见,随着胰岛素浓度的升高,肝细胞 MTP mRNA 丰度(MTP/β-actin灰度比值)不断降低,呈现明显的线性关系,除10 nmol/L与100 nmol/L之间无差异外,其他浓度组间差异显著(P＜0.05);各胰岛素浓度处理组和对照组MTP mRNA丰度也差异显著(P＜0.05)。结果表明,胰岛素对肝细胞MTP mRNA表达具有抑制作用,显著抑制了肝细胞MTP mRNA表达水平,随剂量增加其抑制作用增强,呈现剂量依赖性。

表1 神经内分泌因子对体外培养肝细胞MTP mRNA丰度比较

2.2 胰高血糖素对肝细胞MTP mRNA丰度的影响 随着胰高血糖素浓度的升高,肝细胞 MTP mRNA丰度逐渐下降,呈明显的线性关系,不同浓度组之间差异显著(P＜0.05);各胰高血糖素浓度处理组MTP mRNA丰度均极显著高于对照组(P＜0.01),见表1。结果表明,胰高血糖素对肝细胞MTP mRNA表达具有抑制作用,显著地抑制了肝细胞MTP mRNA表达水平,呈现剂量依赖性增强。

2.3 瘦蛋白对肝细胞MTP mRNA丰度的影响由表 1可见,随着瘦蛋白浓度的升高,肝细胞MTP mRNA 丰度先 增强后减弱 ,除 2.5μg/L和10μg/L之间无差异外,其他不同浓度差异极显著或差异显著(P＜0.01或P＜0.05);对照组和各瘦蛋白浓度处理组MT P mRNA丰度也差异极显著或差异显著(P＜0.01或P＜0.05)。结果表明,瘦蛋白对肝细胞MTP mRNA表达具有低剂量促进而高剂量抑制的作用,且均呈现剂量依赖性,这种双重作用直接影响MTP mRNA表达水平。

3 讨论

3.1 胰岛素影响肝细胞MTP mRNA丰度 胰岛素调节牛肝细胞的代谢,胰岛素在体内调节MTP基因表达中发挥重要作用,是肝MTP基因转录的负调节因子[8-9]。Bremmer D R等[4]检测营养和激素状态对非泌乳荷斯坦奶牛肝和牛原代培养肝细胞中MTP基因表达、活性的影响研究结果表明,在体内肝TG、胰岛素可能影响肝MTP mRNA水平。体外试验也证实TG累积、胰岛素、高血糖素可影响肝MTP mRNA的丰度,但是对MTP的数量和活性没有影响[3]。人肝癌细胞系用10 nmol/L胰岛素孵育6 h,与未加胰岛素组相比,MTP mRNA水平降低了大约30%,胰岛素通过抑制肝MT P mRNA转录,减低了 apoB100与脂质的结合,从而抑制VLDL的组装和分泌[10-11]。本试验结果也证实,胰岛素对肝细胞MTP mRNA表达具有抑制作用,显著抑制了肝细胞MT P mRNA表达水平,随剂量增加其抑制作用增强,呈现剂量依赖性。这表明胰岛素是奶牛肝细胞MTP mRNA表达的抑制因子。

3.2 胰高血糖素影响肝细胞MTP mRNA表达培养液中添加胰高血糖素可调节体外培养牛肝细胞代谢[8]。对鼠的研究表明,胰高血糖素增加溶酶体酸性脂肪酶的活性和apoB100基因的表达[12],因此可直接促进细胞内储存的TG的水解和VLDL的组装和分泌。胰高血糖素抑制脂蛋白的组装和分泌,而且已经在鼠的肝细胞原代培养试验中得到了证实[13]。体外试验证实 TG累积、胰岛素、高血糖素可影响肝MTP mRNA的丰度,但是对MT P的数量和活性没有影响[3]。目前尚未见有关胰高血糖素调控肝MTP mRNA表达的报道。本研究结果显示,胰高血糖素对肝细胞MTP mRNA表达具有抑制作用,且呈剂量依赖性,胰高血糖素可能抑制MTP基因表达,减低中性脂质向内质网腔的转运从而影响VLDL组装与分泌率,调节肝脂转运。

3.3 瘦蛋白可促进和抑制肝细胞MTP mRNA丰度 本试验结果表明,瘦蛋白对肝细胞MTP mRNA丰度具有低剂量促进而高剂量抑制的双重作用,呈现剂量依赖性。在静脉注射瘦蛋白2 h后,大幅度降低鼠肝TG水平,肝脂肪酸氧化和生酮作用增加,同时肝 TG分泌降低[14]。表明瘦蛋白在VLDL的组装、分泌及代谢中具有重要的调节作用。目前研究还没有瘦蛋白对奶牛肝MTP mRNA表达调节作用的报道。Luo G等[15]在研究瘦蛋白对人肝癌细胞系apoM转录调节中得出瘦蛋白并未显著影响肝apoB100和apoE mRNA表达的结论。

4 结语

胰岛素、胰高血糖素和瘦蛋白影响体外培养的新生犊牛肝细胞MTP mRNA的表达,可通过促进或抑制MTP mRNA表达,促进或抑制VLDL组装与分泌率,进而调节肝脂转运。但奶牛肝细胞MTP mRNA表达对VLDL的组装和分泌的调节作用还有待研究。

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