大鼠胃平滑肌细胞的体外分离与三维支架培养方法

郑毅雄，张鲁清，包 祺，陈 奇，姜 明，陈 力

（浙江大学医学院附属第二医院外科，浙江杭州 310009）

全胃切除的患者常常会出现倾倒综合征、反流性食管炎、营养不良和贫血等问题，使得患者的生活质量下降。尽管各种胃替代手术方法被用于临床中，但是重建方式的有效性仍颇受争议。新近的组织工程技术使得胃肠道的人工再造成为可能，研究表明，利用种子细胞、支架材料以及相应的生长因子构建有生物活性的胃肠道，能够增加胃肠黏膜吸收面积，改善胃肠道功能[1-2]。因此，利用组织工程技术在体外形成胃组织进行体内再植，为解决全胃切除术后的营养吸收问题带来了希望。

胃肠道平滑肌层对于胃肠的蠕动功能和病理生理机制具有十分重要的作用。因此，获取大量高纯度的胃肠平滑肌细胞是胃肠组织工程学的必要条件。本研究在显微镜下分离大鼠胃平滑肌，采用酶消化法获取平滑肌细胞，建立稳定的胃平滑肌细胞体外扩增培养模型，并进一步探讨其三维复合培养的可行性，从而为开展相关的组织工程研究打下良好的基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要材料

150～200 g SD大鼠由浙江大学动物实验中心提供，PLGA支架材料由浙江工业大学冯杰教授提供，高糖DMEM培养液（Gibco公司），新生小牛血清（杭州四季青生物技术研究所），胰蛋白酶（Gibco公司），Ⅰ型胶原酶（Sigma 公司），Tissucol凝血酶和纤维蛋白原（Baxter公司），兔抗鼠α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）单克隆抗体（武汉博士德生物公司），碘化丙啶（PI）（Sigma 公司），二乙酸萤光素（FDA）（Sigma 公司），5-溴-2-脱氧尿苷（BrdU）（Sigma公司），恒温二氧化碳细胞培养箱（Heraeus公司），倒置显微镜（IX70，Olympus公司），荧光显微镜（PROVIS AX70，Olympus公司）。

1.2 大鼠胃平滑肌细胞的分离和培养方法

无菌条件下剪取大鼠胃底，将剪下后的组织立即置于含青、链霉素的无菌Hanks液中，移入超净工作台内反复漂洗2～3次，在体视显微镜下仔细去除食物残渣及内膜，翻转至外侧，小心地撕去肠系膜，再仔细地刮去浆膜层，直至余下的组织层在显微镜下观察到呈透明的一层为止。以无菌的Hanks液冲洗3～4次，用眼科剪细剪成1 mm3的小块后加入含0.2%Ⅰ型胶原酶的DMEM培养基3～5 ml，37℃振荡消化4 h后离心（1000 r/min）1 min，弃上清再加入 0.05%胰蛋白酶37℃消化1 h，待消化液浑浊、组织块呈絮状提示消化良好。混悬液经过100目细胞筛过滤后再离心（1000 r/min）5 min，弃上清，将沉淀细胞轻轻吹打混匀后移入细胞培养瓶中，加入含15%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中半开放培养。一般24 h即可见细胞贴壁伸展，2～3 d换液1次，倒置显微镜下观察细胞长成单层和多层交错的致密细胞层时（7 d左右）即可传代培养。

1.3 平滑肌细胞的鉴定

1.3.1 细胞形态学观察 根据平滑肌细胞的形态特点，倒置相差显微镜观察细胞的形态、生长特点和生长方式。

1.3.2 免疫组化染色鉴定 在进行第3代细胞传代时，先将6孔培养皿底部放入盖玻片，然后接种细胞于培养皿内，使细胞在盖玻片上进行贴壁生长，当细胞进入对数生长期后，取出细胞爬片，PBS液清洗后用4℃的纯丙酮固定15～30 min，自然晾干。采用抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体进行免疫组化染色分析。根据SP免疫组化染色的常规方法，显微镜下计数每个视野中染色阳性的细胞占所有细胞的比例，大于98%的平滑肌细胞胞浆棕黄色细丝为阳性结果。

1.4 三维PLGA复合物培养模型的建立

扩增的第三代细胞消化分离前24 h，向培养液中加入14%的BrdU孵育，标记细胞。收集足量的细胞，离心后制成细胞悬液，加入纤维蛋白原（1∶2）混匀，调整细胞浓度至25×106/ml，无菌条件下将消毒的PLGA支架（圆柱型，直径8 mm，高2 mm）放入装有细胞悬液的离心管中，材料充分吸附细胞悬液后，在PLGA支架中形成200 μl/cm3的细胞密度。分别在每个细胞-PLGA支架上滴上2滴凝血酶，37℃培养箱孵育30 min，使得细胞悬液在支架内聚合，构建成PC-PLGA复合物，该复合物转移入含15%胎牛血清DMEM培养基的6孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱中，进行三维培养。每2天换液，7 d和14 d后取出复合物进行检测。

1.5 PI/FDA细胞活性检测

取出细胞-PLGA复合物，PBS洗2次，加FDA 3 ml，37℃培养箱中染色15 min。PBS清洗2次后，加PI避光条件下室温染色2 min。PBS清洗后立即于荧光显微镜下观察，不加染色剂的细胞作为对照。

2 结果

2.1 胃平滑肌细胞形态观察

实验发现，0.2%Ⅰ型胶原酶和0.05%胰酶混合裂解后，组织裂解充分均匀，细胞受损伤轻，接种成功率高。光学显微镜下观察，一般24 h就能发现细胞附壁伸展。以平滑肌细胞为主的纤维样细胞起始可有长短不一的数个细胞突起，呈短梭形，并相互接触，细胞质透明，核卵圆形，居中，多数1个，少数多个，最后细胞逐渐伸展为梭形；密度低时细胞排列常呈网格状排列，密度高时局部地方细胞重叠生长成多层，局部地方甚至没有细胞长入，成典型的“峰-谷”样生长（图1）。1周左右细胞就能生长到进行细胞传代的亚融合状态，此时进行细胞传代，传代后12 h细胞开始贴壁生长，细胞形态正常、生长迅速，5～6 d后可进行下一次传代。

2.2 免疫组织化学染色

特异的抗平滑肌α-SMA免疫组织化学染色后，胞质内可见与细胞长轴平行的纤维细丝，被染成棕黄色，即平滑肌α肌动蛋白丝，细胞平均阳性率≥98%。

2.3 三维PLGA复合物的观察

2.3.1 倒置显微镜观察 细胞接种24 h，细胞-PLGA复合物内可见均匀的细胞分布，周边光线强的部分可见细胞呈圆形黏附于材料上，显示了细胞与材料良好的相容性；中央部分光线较弱，仅见材料网状结构（图2）。

2.3.2 PI/FDA细胞活性检测 荧光显微镜显示，标记的扩增培养细胞均匀分布于材料中，14 d后细胞数目有所减少（图3A）。PI/FDA细胞活性检测显示，7 d时，PLGA支架内细胞均匀分布，90%以上的细胞显示绿色荧光，PLGA纤维仍保持完整，未显示荧光染色。14 d时，细胞形态变为长方形或多边形，存活率仍达90%左右，部分降解的PLGA被PI染成红色（图 3B）。

3 讨论

组织工程学的进步为胃替代方法开启了新的希望，美国Vacanti研究组在2003年开始报道从新生的大鼠中分离出胃上皮类器官单位，接种于管状支架材料上，用于替代成年大鼠的胃[1]，虽然组织学上观察到类似胃壁的上皮隐窝细胞构成的囊腔结构，但是这种方法很难在临床上实现。其原因是：一方面，上皮类器官单位在体外培养基中存活的时间很短，最多24～48 h，之后就会出现退化和死亡；另一方面，构建足量的胃复合物需要取得大量的黏膜组织，在大动物实验以及临床中这是极难达到的[3]。

随着对胃肠壁结构和功能的深入认识，人们发现哺乳动物肠黏膜上皮是机体代谢最为活跃的场所，体内肠黏膜上皮细胞的再生和适应能力非常强，终生进行着不间断的自我更新[4]；但是，小肠黏膜上皮细胞以及隐窝干细胞的体外分离培养存在很大的困难。相反，成熟的平滑肌细胞在体内外可呈现出去分化的潜能，体外培养和扩增平滑肌细胞作为组织工程的种子细胞是切实可行的[5-6]。因此，建立简单可靠的平滑肌细胞模型成为胃组织工程研究的基本要求。目前大鼠原代细胞培养有贴块法和酶解离法。贴块法的细胞生长周期长，细胞纯化速度慢，且有一定的局限性。本文对酶解离法加以改进探索了一种比较简便的胶原酶联合胰酶的解离法，该方法成功地在体外培养了大鼠胃平滑肌细胞，且能在1～2周内获得原代平滑肌细胞，还能较快地获得较大量的种子细胞用于三维支架培养模型的建立，适合于临床应用研究。

生物支架是构建组织工程替代物的另一个关键因素，本研究采用的组织工程复合物三维构建技术，已在在成骨组织工程的构建中被证明切实可行[7]。体外三维支架复合培养模型是将高浓度细胞接种在具有一定的支架材料上，在模拟体内的化学、物理和生物条件下进行培养，通过模拟在体细胞的生长、分化及代谢，直接观察细胞与生物材料复合生长的情况，并能有效地检测细胞的生理功能的变化，有利于了解细胞与材料的相互作用，有助于组织工程支架材料以及组织工程复合物的筛选。本文所采用的方法将细胞包埋于纤维蛋白胶作为细胞外基质，再同支架材料结合，使得细胞在支架中均匀分布和黏附[8]。纤维蛋白胶同时提供一种网状立体支架，对细胞的生长起到支撑作用，使细胞能从三维方向与培养液充分接触，有利于物质交换且可以进行物质和营养交换，亦有利于细胞沿纤维蛋白支架游走和聚集，从而形成特定的组织结构，构建的三维复合具有细胞分布均匀、提供细胞外基质、塑性容易的优点，因而适合在组织工程研究中推广应用。

PI/FDA细胞活性是检测三维复合物中细胞活性的可靠方法，细胞损伤的特征是失去浆膜的完整性。FDA可进入活细胞并被水解成游离荧光和醋酸盐，游离荧光不可透过细胞膜，因而在有活力的细胞里获得绿色荧光，而受损的细胞不显示绿色荧光。相反，PI可跨越不完整的细胞膜，使得死亡或凋亡的细胞获得红色荧光。荧光标记和PI/FDA检测方法可用于体外静态培养和体内植入时观察三维复合物中细胞的生理和代谢特征，有助于下一步用于研究三维平滑肌细胞复合物替代胃肠功能的评价。

[1]Maemura T,Shin M,Sato M,et al.A tissue-engineered stomach as a replacement of the native stomach[J].Transplantation,2003,76(1):61-65.

[2]Langer R,Vacanti JP.Tissue engineering[J].Science,1993,260(5110):920-926.

[3]Rocha FG,Whang EE.Intestinal tissue engineering:from regenerative medicine to model systems[J].J Surg Res,2004,120(2):320-325.

[4]赵京禹,付小兵,陈伟,等.肠道干细胞的研究进展[J].中国临床康复,2004,8(11):2098-2099.

[5]Hosoyamada Y,Sakai T.Structural and mechanical architecture of the intestinal villi and crypts in the rat intestine:integrative reevaluation from ultrastructural analysis[J].Anat Embryol(Berl),2005,210(1):1-12.

[6]Guyton,AC,Hall JE.Textbook of medical physiology[M].Philadelphia:Harcourt,2001:87-94.

[7]Zheng YX,Ringe J,Liang Z,et al.Osteogenic potential of human periosteum-derived progenitor cells in PLGA scaffold using allogeneic serum[J].J Zhejiang Univ Sci B,2006,7(10):817-824.

[8]Karp JM,Sarraf F,Shoichet MS,et al.Fibrin-filled scaffolds for bonetissue engineering:an in vivo study[J].J Biomed Mater Res A,2004,71(1):162-171.