蛇床子素内酯环完整性对抑真菌活性的影响

兰树敏 ，梅清华 ，林敬明 ，龚文菲 ，林茂锐

（1.广东省第二人民医院，广东广州 510317；2.南方医科大学珠江医院，广东广州 510282）

蛇床子为伞形科蛇床属植物蛇床[Cnidium monnieri（L）Cuss]的干燥成熟果实，性温，有小毒，外用燥湿杀虫止痒，内服温肾壮阳，祛风燥湿[1]，是常用外用中药。其主要成分蛇床子素（osthole）药理活性广泛，在皮肤的作用主要有抑制过敏（止痒），对细菌、真菌和病毒都有杀灭和抑制作用[2-4]。osthole分子结构中有一个内酯环，有研究指出[5]，pH=5以上会导致内酯环开环，从而失去抑真菌活性，但具体影响未见报道。本实验比较了该内酯环开环前后osthole对临床浅部真菌病主要致病菌须毛癣菌、红色毛癣菌和石膏样小孢子菌的抑菌活性，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与培养基 须毛癣菌、红色毛癣菌和石膏样小孢子菌实验菌株均为珠江医院临床分离株。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）和沙氏培养基，按照说明配制，115℃高压蒸汽灭菌20 min，备用。

1.1.2 供试品溶液制备 取osthole 0.5 g，加50 ml乙醇，溶解，加甘油 50 ml，吐温-8010 ml，加水稀释至 500 ml，搅拌均匀，分出2瓶，各100 ml，分别调 pH值，一瓶以盐酸溶液（9→1000）调整pH值至4.0，另一瓶用氢氧化钠溶液调整pH值至9.0，得0.1%osthole溶液。同法制备不含osthole的两种pH值空白溶液，均以0.25 μm微孔滤膜行无菌滤过，即得。

1.2 方法

1.2.1 菌种制备[6]取须毛癣菌、红色毛癣菌和石膏样小孢子菌，28℃用PDA活化7 d，在菌落上加入含有0.01 ml吐温-20的0.85%氯化钠溶液1 ml，得菌悬液。静置3～5 min，待大颗粒沉于底部，取上层均质液体至无菌小管，振荡15 s，用比浊仪测定菌悬液浓度，调整至3×106cfu/ml，以生理盐水稀释10倍，得终浓度为3×105cfu/ml的接种液。

1.2.2 接种及培养 取无抗性的PDA固体培养基，均匀涂布接种液，放置含200 μl各相应供试品溶液的滤纸片（直径:10 mm），每种供试品溶液平行做3份，28℃培养5 d。取出，量取抑菌圈直径。

1.2.3 数据处理 组间比较采用t检验，均以P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有极显著性差异。

2 结果

培养后量取的抑菌圈直径见表1。

osthole溶液pH=4.0与pH=9.0相比，对须毛癣菌的抑菌圈直径前者大于后者，有极显著性差异（P＜0.01），对红色毛癣菌和石膏样小孢子菌则没有区别（P＞0.05）。空白溶液pH=4.0与pH=9.0相比，对三种真菌的抑菌圈直径后者均大于前者，对须毛癣菌和红色毛癣菌有极显著性差异（P＜0.01），对石膏样小孢子菌有显著性差异（P＜0.05）。osthole溶液与空白溶液相比，当pH=4.0时，前者对三种真菌的抑菌圈直径均远大于后者（P＜0.01）；pH=9.0时，对须毛癣菌的抑菌圈直径两者没有区别，对红色毛癣菌和石膏样小孢子菌则osthole溶液远大于空白溶液（P＜0.01）。

表1 不同pH osthole溶液对常见浅部真菌抑菌活性Tab.1 The antifungal activity of osthole solution with different pH to superficial mycosis

3 讨论

osthole溶液在pH=5以上时内酯环会开环，本实验分别配制pH=4.0和pH=9.0的溶液，前者内酯环保持完整，后者内酯环被破坏。通过比较两者对临床浅部真菌病主要致病菌的抑菌圈直径大小，可以初步观察osthole内酯环完整性对其抑真菌活性的具体影响。

osthole在水中几乎不溶，本实验采用的是乙醇∶甘油∶吐温-80∶水（50∶50∶10∶390）的混合溶媒，配制 0.1%的溶液时溶解过程比较容易。鉴于溶媒中含有一定浓度的乙醇（10%），且pH相差较大，为避免影响实验结果，在比较不同pH值的osthole溶液抑菌活性时，同时考察了两种pH溶媒的抑菌活性。

须毛癣菌、红色毛癣菌和石膏样小孢子菌是临床浅部真菌病主要致病菌[7-8]，pH=4.0的空白溶液对三者均没有表现出任何抑菌活性。但pH=9.0的空白溶液对三者均表现出一定的抑菌活性，尤其对须毛癣菌，抑菌活性与相同pH的osthole溶液相当。这说明，碱性环境对真菌有一定的抑制作用，但对不同的真菌，抑制作用强度有区别，须毛癣菌和红色毛癣菌对碱性环境敏感，而石膏样小孢子菌则影响很小。

对须毛癣菌而言，pH=9.0的osthole溶液与pH=9.0的空白溶液抑菌圈直径几乎相当（22 mm∶21 mm，P＞0.05），都比pH=4.0 osthole溶液（32 mm）的抑菌圈直径小很多，说明osthole内酯环被破坏后抑菌活性完全丧失。对红色毛癣菌和石膏样小孢子菌而言，虽然pH=9.0的空白溶液有一定的抑菌作用，但比同pH的osthole溶液要弱很多（抑菌圈直径对比，P＜0.01），而两种pH的osthole溶液抑菌圈直径几乎相当（抑菌圈直径对比，P＞0.05），说明osthole内酯环被破坏后抑菌活性不受影响。

综上所述，osthole对常见临床浅部真菌病主要致病菌均有较好的抑制作用，其分子中内酯环的完整性与此抑制作用没有必然的联系，视乎具体菌种会有绝然不同的效果。内酯环被破坏后，可能完全丧失抑菌活性（如须毛癣菌），亦可能完全没有影响（如红色毛癣菌和石膏样小孢子菌）。由于碱性环境恰好对须毛癣菌有较好地抑制作用，就osthole而言，碱性环境下，内酯环被破坏对其抗浅部真菌病主要致病菌作用影响不大。

[1]中国药科大学.中药辞海[M].三卷.北京:中国医药科技出版社,1997:345-349.

[2]Matsuda H,Tomohiro N,Ido Y,et al.Anti-allergic effects of cnidium monnieri fructus(dried fruits of Cnidium monnieri)and its major component:Osthol[J].Biol Pharm Bull,2002,25(6):809-812.

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[4]王昊,杨红伟,杨凤琴,等.丹参、苦参、蛇床子等十种中草药对致病性浅部真菌的抑制实验研究[J].宁夏医学杂志,1997,19(4):193-195.

[5]高永荣,李占林,苏隽.蛇床子素注射液的制备及稳定性考察[J].河北北方学院学报:医学版,2006,23(5):31-32.

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