明胶胶体金探针及胶体金标记空微囊的制备*

王秀珍，杨 捷

（绍兴文理学院，浙江 绍兴 312000）

自1962年首次介绍胶体金可作为一种电镜示踪的标志以来，同DNA、RNA、蛋白质、糖的复合物等已用于组织细胞定位、某些物质在机体代谢中转动方式、病理学和分子生物学等多个研究领域。从结构上看，胶体金表面带负电荷而壳聚糖、明胶等微囊材料表面带正电荷，它们之间可形成非共价键的静电吸引而牢固结合。因此，以明胶为微囊囊材，使之先与胶体金特异结合，再用标记过的囊材制备微囊，于不同的时间取给药动物的不同组织和脏器，电镜观察胶体金的分布就可得到胶体金标记微囊在体内的分布情况。胶体金技术与荧光素标记法相比，具有制作方便、价格低廉、容易操作、无放射性污染等优点；与血、组织药物浓度测定法相比较，大大提高了准确性并简化了试验操作。把电子显微镜的胶体金技术应用于研究药物体内分布，将是药物研究方法的一大进步，对于药代动力学研究具有重要意义。本试验摸索了在实验室条件下明胶胶体金探针及胶体金标记明胶-阿拉伯胶空微囊的制备方法，现报道如下。

1 仪器与试药

HHS-4S型电子恒温不锈钢水浴锅（上海南洋仪器有限公司）；GS12-2型电子恒速搅拌器（上海医械专机厂）；PB303-N型电子精密天平；LG10-24A型台式高速离心机；电子万用炉（浙江省上虞市道墟立明化验仪器厂）；XS-212-303型摄影生物显微镜；JEOL-1011型透射电子显微镜（日本电子）。氯化金（AuCl3·HCl·4H2O，国药集团化学试剂有限公司）；明胶（化学纯）、阿拉伯树胶（中国医药集团上海化学试剂厂）；甲醛（分析纯，浙江省兰溪市二轻试剂厂）；柠檬酸三钠（分析纯，上海试剂一厂）；碳酸钾（分析纯，宜兴市第二化学试剂厂）；乙酸（分析纯，中国杭州化学试剂有限公司）；氯化钠（分析纯，宁波市化学试剂厂）；液体石蜡（化学纯，中国上海试剂总厂）。

2 方法与结果

2.1 胶体金制备

采用柠檬酸三钠法。将0.01%氯金酸（HAuCl4）水溶液100 mL在电子万用炉上加热至沸腾，然后迅速加入1%柠檬酸三钠水溶液4 mL，继续加热，约5 min后出现橙红色。这时制得的胶体金颗粒直径约为15 nm。颗粒直径大小随柠檬酸三钠用量减少而增加。凉至室温后，置6℃冰箱保存备用。

2.2 胶体金探针制备及最少明胶用量确定

取10 g明胶，溶于90 mL水中，制成10%的明胶溶液。取1 mL（即含有0.1 g明胶），依次稀释成系列质量浓度的明胶溶液（0.1，0.075，0.05，0.025，0.02，0.015，0.01，0.0001，0.00003，0.00002，0.00001，0.000001 g/mL）。取10支试管，分别加入上述用柠檬酸三钠法制备好的胶体金溶液1 mL，然后加入稀释好的明胶溶液，对照管不加明胶溶液。用0.1 mol/L K2CO3调pH至明胶的等电点（pH=9），5 min后，各管加 2 滴10%NaCl溶液，静置2 h，透射电镜观察胶体金标记状况[1-2]。结果只有对照管，0.000001，0.00001 g/mL的溶液管变成蓝色，其余各管仍呈红色。电镜观察胶体金粒径为5～10 nm，与明胶结合并被吸附在明胶胶团表面，胶体金颗粒没有全部被吸附（图1）。结果显示，明胶能与胶体金特异结合，保护胶体金免于絮集，且保护1 mL胶体金的最少明胶用量为0.00002 g/mL。

图1 胶体金与明胶结合被吸附在明胶胶团表面的电镜图（Bar=100μm）

2.3 胶体金微囊制备[3]

用胶体金标记明胶：取11.5 g明胶溶液（30%），置锥形瓶中，在40℃下加热，并用电子搅拌器（转速 ω=400 r/min）搅拌10 min，其间加入20 mL胶体金（用0.03%氯金酸制备），且用0.1 mol/L K2CO3调 pH=9。

胶体金标记微囊制备：在上述标记过的明胶溶液中加入2.5 g液体石蜡形成乳状，然后再加入11.5 g 10%阿拉伯树胶，混合均匀后，电子恒速搅拌0.5 h（ω=400 r/min），并且在水浴锅中40℃加热。搅拌期间，用10%醋酸溶液调pH至4.5。此时形成了凝聚囊。然后放在冰箱中冷至5℃。取出，加0.6 mL 30%甲醛，在50℃（每min升高1℃）的水浴锅中加热。加10%NaOH调pH至9，制成固化囊，用水洗至无甲醛，此时形成胶体金标记的微囊。用透射电镜观察微囊内胶体金状况。结果微囊粒径为0.5～5μm，囊壁厚度为50～130 nm，囊壁内有标记的胶体金颗粒，胶体金粒径约为5 nm，囊内包裹有未被明胶吸附的胶体金颗粒（图 2）。

图2 胶体金标记明胶-阿拉伯胶微囊电镜图（Bar=200μm）

3 讨论

在透射光下，直径小于80μm的球形颗粒通常呈红色，若颗粒大且不呈球形则为蓝色，当金属颗粒聚集在一起时也可呈蓝色。胶体金溶液在可见光谱范围内的吸收峰值为520～540 nm。电解质溶液可引起胶体金的凝聚，而明胶溶液可以保护胶体金溶液不受电解质的影响。也就是说，由于明胶的保护，即使加入盐溶液，胶体金溶液也不会从红色变为蓝色。

明胶是两性电解质，在水溶液中分子上有-NH3+和-COO-，但所含正负离子的多寡受介质pH的影响。在达到一定pH时，这2种荷电相反的基团数目相等。酸法明胶等电点为pH=7～9，当明胶溶液的pH在等电点以上时，因夺去了-NH3+上的质子（H+），相应地增加了分子上的-COO-，故荷负电；反之，pH在等电点以下时，因抑制了-COOH的解离，分子上相应的-NH3+增多，故荷正电。因此，只需调节溶液的pH就可使明胶分子荷正电或荷负电[4-5]。当将明胶加入胶体金溶液时，调节pH=9，是由于在此pH下明胶2种荷电相反的基团数目基本相等，而胶体金探针在此条件下最易形成；胶体金对明胶的吸附主要取决于pH，在接近明胶的等电点或略偏碱的条件下，二者易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH低于明胶的等电点时，则会聚集而失去结合能力。因此，制备过程必须掌握好pH值。

阿拉伯胶分子上只含-COOH基团，故在水溶液中荷负电，不易受pH影响。复凝聚包囊工艺就是利用明胶和阿拉伯胶的这一特性，在它们组成的体系里调节pH达明胶等电点以下的pH（4.5），使其荷正电量最高，与荷负电的阿拉伯胶反应形成复合物而凝聚、析出。因此，虽然胶体金和阿拉伯胶都含负电荷，但胶体金与明胶的结合并不影响明胶与阿拉伯胶的结合，且胶体金与明胶结合得非常牢固，当明胶与阿拉伯胶结合时，对明胶探针的稳定性无影响。试验证明，胶体金能很好地标记明胶微囊类药物。

[1]王福勇.胶体金探针的制备与应用[J].国外医学·临床生物化学与检验学分册，1991，12（4）：145-148.

[2]张健宁，沙家豪.胶体金-ConA探针的制备方法[J].南京医学院学报，1989，9（2）：148-150.

[3]刘国杰.药剂学[M].北京：人民卫生出版社，1985：2.

[4]姚日生.药用高分子材料[M].北京：化学工业出版社，2003：6.

[5]孙秀兰，赵晓联，汤 坚.单分散性胶体金的制备工艺优化[J].免疫学杂志，2004，20（2）：151-154.