氯化锂对脾切除大鼠海马tau蛋白的影响

谭文斐，田阿勇，王俊科，曹学照，马 虹

(中国医科大学第一医院麻醉科，辽宁 沈阳 110001)

氯化锂能够抑制糖原合成酶-3β(GSK-3β)，对蛋白激酶的活性进行调节［1］，进而影响 tau蛋白磷酸化。近些年，术后认知功能障碍逐渐成为研究热点，但是，对于手术创伤诱发中枢神经系统炎性反应如何影响与记忆有关的tau蛋白的研究并不多见。研究提示，手术创伤引发了大鼠短暂的记忆下降，并且伴随有海马内炎性因子的释放［2］。因此，探讨手术创伤诱发海马炎性因子是否通过GSK-3β通路介导tau病理变化是很有意义的。

1 材料与方法

1.1 动物和手术 150只♂ 6月龄SD大鼠吸入异氟烷麻醉诱导后气管插管，机械通气维持异氟烷浓度为1.5%，麻醉期间保持大鼠直肠温度在(36～37)℃。大鼠随机分为4组:健康对照组(group A，n=15);麻醉组(group B，n=45);手术和氯化钠组(group C，n=45)，异氟烷麻醉后脾切除，腹腔注射氯化钠;手术和氯化锂组(group D，n=45)，异氟烷麻醉后脾切除，腹腔注射氯化锂 200 mg·kg－1［3］，从实验开始持续至术后7 d，每天1次。氯化钠组给予同等容积的氯化钠。B、C、D组所有动物均麻醉2 h，B组麻醉2 h后即刻处死，C，D 组手术后 1、3、7 d处死(15只/时点)。每个时点标记为 B1、B3、B7、C1、C3、C7、D1、D3 和 D7。

1.2 方法

1.2.1 Real-time PCR 按照参考文献［4］，利用 Applied Biosystems(ABI公司，美国)系统进行实时定量 PCR。大鼠 IL-1β上游引物:5'-ATCCCAAACAATACCCA-3'，下游引物:5'-CAACTATGTCCCGACCA-3';TNF-α上游引物:5'-CCACGC TCTTCTGTCTACTG-3'，下 游 引 物:5'-GCTACGGGCTTGTCACTC-3';3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)上游引物:5'-GCAAGTTCAACGGCACA-3'，下 游 引 物:5'-CATTTGATGTTAGCGGGAT-3'。PRISM 7500HT检测系统(ABI公司，美国)进行荧光测定，以 GAPDH为对照，IL-1β mRNA和 TNF-α mRNA 为 测 试，对 循 环 数 Ct值 计 算 后 (比 值(测试/对照)=2Ct对照－Ct测试)进行比较。

1.2.2 Western blot 按照参考文献［5］，海马组织用溶解液匀浆处理后提取蛋白。蛋白提取物置入加样缓冲液，100℃煮沸5 min，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜。分别与一抗(1∶500，Signalway Antibody，美国)4℃过夜。其后，膜与辣根过氧化物酶结合二抗室温孵育2 h。最后膜与ECL系统曝光，成像。以β-actin的光密度值做为内参照，采用目标条带与β-actin的光密度值比值做为指标进行统计学分析。

2 结果

2.1 手术创伤诱发炎性反应 与A组比较，B组各时点IL-1β mRNA、TNF-α mRNA、IL-1β 和 TNF-α 的表达水平差异无统计学意义(P＞0.05)，C组、D 组术后 IL-1β mRNA、TNF-α mRNA和IL-1β的表达上调(P＜0.01)，见 Tab 1。

Tab 1 Expression of IL-1β and TNF-α mRNA and protein(±s，n=5)

Tab 1 Expression of IL-1β and TNF-α mRNA and protein(±s，n=5)

＊＊P＜0.01 vs group A

Group IL-1β mRNA TNF-α mRNA IL-1β TNF-α A 1.04 ±0.05 1.20 ±0.07 0.60 ±0.01 0.39 ±0.01 B1 1.26 ±0.05 1.34 ±0.05 0.62 ±0.01 0.38 ±0.01 B3 1.44 ±0.05 1.26 ±0.05 0.60 ±0.02 0.40 ±0.01 B7 1.40 ±0.10 1.24 ±0.05 0.61 ±0.01 0.41 ±0.02 C1 2.52 ±0.08＊＊ 1.47 ±0.04＊＊ 1.15 ±0.05＊＊ 0.40 ±0.01 C3 1.54 ±0.09＊＊ 1.22 ±0.08 0.59 ±0.02 0.39 ±0.03 C7 1.14 ±0.05 1.22 ±0.04 0.58 ±0.01 0.40 ±0.01 D1 2.46 ±0.09＊＊ 1.48 ±0.01＊＊ 0.98 ±0.03＊＊ 0.40 ±0.03 D3 1.54 ±0.05＊＊ 1.24 ±0.05 0.59 ±0.02 0.39 ±0.02 D7 1.16 ±0.09 1.22 ±0.04 0.59 ±0.03 0.40 ±0.02

Tab 2Expression of site-specific phosphorylation of tau and GSK-3β(±s，n=5)

Tab 2Expression of site-specific phosphorylation of tau and GSK-3β(±s，n=5)

＊＊P＜0.01 vs group A

Group Total tau pT205 pS396 GSK-3β pGSK-3β A 76 ±0.02 B1 1.14 ±0.04 1.22 ±0.03 0.96 ±0.02 0.91 ±0.04 0.76 ±0.03 B3 1.12 ±0.04 1.23 ±0.05 0.97 ±0.05 0.91 ±0.04 0.79 ±0.07 B7 1.14 ±0.05 1.21 ±0.04 0.96 ±0.01 0.91 ±0.05 0.77 ±0.07 C1 1.14 ±0.05 1.23 ±0.08 0.97 ±0.06 0.92 ±0.02 0.76 ±0.04 C3 1.15 ±0.02 4.53 ±0.05＊＊ 2.15 ±0.03＊＊ 0.90 ±0.06 0.34 ±0.08＊＊C7 1.14 ±0.02 1.22 ±0.06 0.96 ±0.06 0.89 ±0.04 0.76 ±0.06 D1 1.14 ±0.04 1.22 ±0.01 0.97 ±0.01 0.91 ±0.04 0.75 ±0.08 D3 1.14 ±0.04 1.23 ±0.02 0.95 ±0.05 0.89 ±0.06 0.76 ±0.07 D7 1.14 ±0.02 1.22 ±0.05 0.95 ±0.05 0.91 ±0.02 0 1.16 ±0.04 1.22 ±0.01 0.97 ±0.03 0.91 ±0.02 0..76 ±0.07

2.2 炎症反应通过激活GSK-3β诱发tau蛋白磷酸化 与A 组比较，B 组各时点 tau、pT205、pS396、GSK-3β 和 p-GSK-3β的表达水平差异无统计学意义(P＞0.05)，C组术后pT205和 pS396的表达上调，而 p-GSK-3β表达下调(P＜0.01)。D组给予氯化锂后 pT205、pS396和 p-GSK-3β的表达恢复对照水平，说明GSK-3β活性抑制后 tau蛋白磷酸化水平恢复，见Tab 2。这些结果提示，炎性因子对 tau蛋白磷酸化的影响是通过GSK-3β介导的。

3 讨论

Tau蛋白在非神经源性细胞中的过度表达可诱导细胞凋亡［6］，而磷酸化 tau蛋白可以诱发神经细胞病理变化［7］，损害记忆形成。脾切除术可反映切除一个器官的手术创伤，同时脾又是一个免疫器官，实施脾切除术大鼠海马内激活炎性因子的释放［2］。有研究表明GSK-3β可以被炎性因子 IL-1β和TNF-α激活，导致苏氨酸205位点 tau蛋白磷酸化增加［8］。还有研究发现氯化锂可通过诱导失活形式的 p-GSK-3β表达增高而抑制GSK-3β的活性，进而抑制Tau蛋白磷酸化［5］。这些结果都支持本研究结论。

本研究发现接受脾切除的大鼠，海马内炎性因子可以激活GSK-3β，诱发 tau蛋白高度磷酸化。利用氯化锂抑制GSK-3β的活性，可以使高度磷酸化的tau蛋白恢复正常对照组水平。氯化锂可能成为治疗术后认知功能障碍的临床策略中一个选择。

［1］ Li X，Bijur G N，Jope R S.Glycogen synthase kinase-3beta，mood stabilizers，and neuroprotection［J］.Bipolar Disord，2002，4(2):137－44.

［2］ Wan Y，Xu J，Ma D，et al.Postoperative impairment of cognitive function in rats:a possible role for cytokine-mediated inflammation in the hippocampus［J］.Anesthesiology，2007，106(3):436 － 43.

［3］ Tsaltas E，Kontis D，Boulougouris V，Papadimitriou G N.Lithium and cognitive enhancement:leave it or take it［J］.Psychopharmacology(Berl)，2009，202(1 －3):457 －76.

［4］ Rosczyk H A，Sparkman N L，Johnson R W.Neuroinflammation and cognitive function in aged mice following minor surgery［J］.Exp Gerontol，2008，43(9):840 － 6.

［5］ 孙治坤，杨红旗，陆国强，等.氯化锂抑制β-淀粉样蛋白诱导细胞 Tau蛋白磷酸化［J］.中国药理学通报，2008，24(1):24－8.

［5］ Sun Z K，Yang H Q，Lu G Q，et al.The effects of LiCl on Tau phosphoryla tion induced by β-amyloid peptide［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(1):24 －8.

［6］ 李 琪，冯利杰，王海萍，等.tau蛋白的过度表达对非神经源细胞生长与分化的影响［J］.中国药理学通报，2008，24(3):365－9.

［6］ Li Q，Feng L J，Wang H P，et al.Effects of tau overexpression on non-neuronal cell growth and differentia tion［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(3):365 － 9.

［7］ 褚燕琦，张 兰，李 玮，等.人参皂苷对蛋白磷酸酶抑制剂冈田酸拟阿尔采末病细胞模型的影响［J］.中国药理学通报，2008，24(7):879 －84.

［7］ Chu Y Q，Zhang L，Li W，et al.Effects of ginsenoside on cellular model of Alzheimer disease induced by protein phosphatase inhibitor okadaic acid［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(7):879 －84.

［8］ Kitazawa M，Trinh D N，LaFerla F M.Inflammation induces tau pathology in inclusion body myositis model via glycogen synthase kinase-3beta［J］.Ann Neurol，2008，64(1):15 － 24.