HtrA2/Omi与Survivin在胰腺癌中的表达及临床意义

杨军凯，刘 佳，张炳太

（1.山西医科大学第二医院普通外科，山西太原 030001；2.太原市中心医院，山西太原 030009）

胰腺癌是恶性程度很高、预后很差的肿瘤，5年生存率＜5.0%，其发生是一个多因素、多阶段、多基因变异累积的复杂过程，细胞的凋亡与增殖在癌症进展中发挥重要作用。促凋亡蛋白HtrA2/Omi可有效参与细胞凋亡过程，而Survivin是一种凋亡抑制蛋白，其特殊的分子结构及在细胞凋亡中发挥的功能也早已引起人们的关注。本研究通过观察胰腺癌中HtrA2/Omi、Survivin蛋白的表达情况，揭示两者之间的关系，进一步探讨其与胰腺癌发生、发展的关系，并为胰腺癌的诊断及治疗提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

病例组40例，均为2005年10月～2009年10月我院手术切除并经临床诊断和病理检查确诊的胰腺癌患者，所有病例术前均未接受过放疗或化疗，其中，男24例，女16例；年龄42～78岁，平均52岁。按1997年UICC制订的TNM分期，Ⅰ期8例，Ⅱ期15例，Ⅲ期13例，Ⅳ期4例；伴淋巴结转移15例。病理分化程度：高、中分化15例，低分化25例。选择癌旁正常胰腺组织20例作为对照。所有标本均经10%甲醛溶液固定，常规酒精脱水，石蜡包埋，4 μm厚连续切片。

1.2 实验试剂与仪器

兔抗人HtrA2/Omi多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，兔抗人Survivin多克隆抗体购自福州迈新生物有限公司，SP试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。

1.3 实验方法

使用免疫组化SP法检测胰腺癌及癌旁正常胰腺组织中HtrA2/Omi和Survivin的表达及分布情况，操作步骤依试剂盒说明书进行。

1.4 结果判定

HtrA2/Omi与Survivin均采用半定量积分法，将染色强度分为3级：无着色1分，浅着色2分，棕黄色3分；按阳性瘤细胞的百分比分3级：<25%为1级计1分，25%～75%为2级计2分，>75%为3级计3分。每张切片最后的得分为2次评分的乘积（1～9分），＜3分为阴性；≥3分为阳性，其中，3～4 分为（+），5～6 分为（++），7～9 分为（+++）。

1.5 统计学分析

数据采用SPSS 13.0软件分析，免疫组织化学的阳性率比较采用χ2检验，指标间相关性用Spearman秩相关进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HtrA2/Omi的表达

HtrA2/Omi在癌旁正常胰腺组织细胞的胞质中存在表达（图1），阳性表达率为30.0%，在胰腺癌中呈高表达（图2），阳性表达率为82.5%，以胞质呈棕黄色为阳性细胞，与肿瘤TNM分期、分化程度相关（表1）。胰腺癌组织中的HtrA2/Omi阳性细胞数明显高于癌旁正常胰腺组织（表2）。两组HtrA2/Omi阳性表达率比较，差异有统计学意义（P<0.05）。

图1 HtrA2/Omi在正常胰腺中的表达（SP×200）Fig.1 The expression of HtrA2/Omi in normal pancreas （SP×200）

图2 HtrA2/Omi在胰腺癌中的表达（SP×200）Fig.2 The expression of HtrA2/Omi in pancreatic carcinoma （SP×200）

2.2 Survivin的表达

Survivin在癌旁正常胰腺组织细胞中无阳性表达或低表达（图3），阳性表达率为0，在胰腺癌组织胞核或胞质中呈高表达（图4），阳性表达率为72.5%。Survivin以胞核或胞质呈棕黄色为阳性表达细胞，与肿瘤TNM分期、分化程度、肿瘤转移相关（表1）。胰腺癌组织中的Survivin阳性细胞数明显高于癌旁正常胰腺组织（表2）。两组Survivin的阳性表达率比较，差异有统计学意义（P<0.05）。

表1 胰腺癌组织中HtrA2/Omi、Survivin的表达与临床病理学参数的关系（例）Tab.1 The relationship between the expression of HtrA2/Omi and Survivin in pancreatic carcinoma and the clinical pathology （case）

表2 HtrA2/Omi、Survivin在癌旁正常胰腺和胰腺癌组织中的表达（例）Tab.2 The expression of HtrA2/Omi and Survivin in normal pancreas and pancreatic carcinoma （case）

图3 Survivin在正常胰腺中的表达（SP×200）Fig.3 The expression of Survivin in normal pancreas （SP×200）

2.3 HtrA2/Omi、Survivin之间的相关性分析

胰腺癌组中HtrA2/Omi的阳性表达与Survivin的阳性表达关系不大（r=0.105，P＞0.05）（表 3）。

图4 Survivin在胰腺癌中的表达（SP×200）Fig.4 The expression of Survivin in pancreatic carcinoma （SP×200）

表3 HtrA2/Omi表达与Survivin表达的相关性（例）Tab.3 The correlation between the expression of HtrA2/Omi and Survivin （case）

3 讨论

细胞凋亡是多细胞生物为维持自身稳定、调控自身细胞增殖和死亡之间的平衡而由基因控制的细胞自主的有序死亡，这一过程的紊乱与许多疾病的发生、发展有关，尤其与肿瘤的发生、发展关系密切。HtrA2/Omi是一种重要的促凋亡蛋白，是一种寡聚丝氨酸蛋白酶，存在于大部分正常组织器官中，它由458个氨基酸残基组成，分子量为51 kD，编码基因位于染色体2q13（或2p12），含有8个外显子[1]。在最初的研究中发现，当细胞受到凋亡刺激时，HtrA2/Omi可由线粒体膜间隙（mitochondrial intermembrane space）释放进入细胞质中，接着出现大量的细胞凋亡性死亡，这些现象表明HtrA2/Omi与细胞凋亡之间有着密切的关系[2-3]。

凋亡抑制蛋白家族（inhibitors of apoptosis family of protein，IAPs）是一类有抗凋亡活性的蛋白，至今已发现6个人类IAPs家族成员：XIAP、cIAP1/HIAP2、cIAP2/HIAP1、NIAP、Survivin、BRUCE[4]。IAP 主要有 3个结构域，BIR、RING、CARD 结构域，其中BIR结构域全称为杆状病毒IAP重复序列，为IAP抑制细胞凋亡所必需的，所有IAP家族成员至少含有一个BIR，大多数含有3个BIR[5]。Aurvivin是IAP家族中结构独特的新成员，于1997年由耶鲁大学的Smbrosini等[6]用效应细胞蛋白酶受体-1（effector cell protease receptor-1，EPR-1）cDNA在人类基因组库的杂交筛选中首先分离出来。Survivin与其他IAP成员不同，Survivin单体NH3端只含有一个BIR结构。Survivin表达于胚胎、胎儿组织[7]以及大多数常见的肿瘤组织，如肺、胃、结肠、胰腺、乳腺、肝脏、前列腺以及大约50%的非霍奇金淋巴瘤，但不表达于终末分化的成人组织中[6]。Survivin是迄今发现最强的凋亡抑制因子，Caspase-3作为Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点，它的活化是凋亡进入不可逆阶段的标志[8]，Survivin通过一种BIR依赖性的方式与Caspase-3和Caspase-7相结合，并抑制其活性，从而抑制凋亡。Satoh等[9]发现，Survivin在胰腺肿瘤细胞中有表达，在正常胰腺或慢性胰腺炎细胞中不表达，与本研究结果一致。

当细胞受到凋亡刺激时，完整的HtrA2/Omi能进行自我加工，去除N末端133个氨基酸残基的跨膜部分，形成成熟的HtrA2/Omi[10]，并从线粒体膜间隙穿过线粒体膜，到达细胞质中与IAPs结合，从而解除IAPs对Caspases的抑制。同时，HtrA2/Omi对IAPs的抑制作用不仅仅来自于对IAPs的直接结合降解作用，它还可以抑制IAPs蛋白的翻译[11]。HtrA2/Omi除了通过促进Caspase活化参与细胞凋亡过程外，还可以直接利用其蛋白酶活性发挥促凋亡作用[1]。

在本实验中发现，HtrA2/Omi、Survivin在胰腺癌中的表达均明显增高。HtrA2/Omi的表达与胰腺癌的分化、分期相关，在分化差和临床晚期胰腺癌组织中HtrA2/Omi表达减少，而在肿瘤分化高和临床早期肝癌组织中结果相反，提示HtrA2/Omi与胰腺癌的发展密切相关，可能促进了胰腺癌细胞的凋亡，其减少或缺失是胰腺细胞发生、发展、浸润和转移过程中的一个重要因素。Survivin的表达与性别、年龄、肿瘤部位并无相关性，但在有无远处转移、高分化与低分化癌、Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ、Ⅳ期间有显著差异，表明Survivin在胰腺肿瘤从良性到恶性的转化中起重要作用，并进一步促进肿瘤发展。以Survivin为靶点治疗胰腺癌目前尚处于实验阶段，对基因治疗的疗效和风险也仍然存在较大争议，但Survivin特异表达于大多数肿瘤组织这一特点为治疗胰腺癌提供了新思路，临床应用前景乐观；但在本研究中发现HtrA2/Omi与Survivin关系不大，说明两者在细胞凋亡通路中，通过不同途径发挥各自的生物学作用，HtrA2/Omi不作用于Survivin，这与Verhagen等[12]的报道一致，可能与Survivin独特的结构有关，同HtrA2/Omi无法结合降解。这就需要我们进一步探索能有效抑制Survivin的特异性促凋亡蛋白，促进肿瘤细胞凋亡，为恶性肿瘤的治疗提供新途径，为肿瘤基因治疗提供新的可能的靶位。同时，进一步深入研究HtrA2/Omi、Survivin在胰腺癌细胞生长中的作用对胰腺癌的治疗有重要意义。

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