沙苑子及其炮制品中沙苑子苷A和鼠李柠檬素的含量测定研究

孙建中， 张 怀， 贾天柱*， 张 希

(1.辽宁中医药大学，2.辽宁省中药炮制工程技术研究中心，辽宁大连116600;3.威海市中医院，山东威海264200)

沙苑子为豆科植物扁茎黄芪Astragalus complanatus R.Br.的干燥成熟种子［1］。具有温补肝肾、固精、缩尿、益肝明目的功能。沙苑子的炮制工艺具有悠久的历史，盐炙法是沙苑子最常用的炮制方法。现代研究表明，本品所含化学成分主要有氨基酸、黄酮类、三萜类、脂肪酸以及微量元素等［2］。据有关文献［3］记载，沙苑子苷A是沙苑子中主要的生物活性成分之一，具有保护肝细胞、抑制肝纤维化形成的作用;鼠李柠檬素对体外部分肿瘤细胞有直接抑制作用，而且都随着浓度的增加，抑制作用增强［4］。目前还尚未见有同时测定沙苑子苷A和鼠李柠檬素的HPLC含量测定的报道。

本实验以沙苑子苷A和鼠李柠檬素为对照品，建立了其含量测定方法，同时考察了沙苑子炮制前后沙苑子苷A和鼠李柠檬素的变化情况，为沙苑子的炮制研究提供依据。

1 仪器与试药

Agilent 1100 series高效液相色谱仪(包括G1314 VWD检测器、G1379A真空脱气机、G1311A四元泵);LG烧烤型微波炉［S/NO303TA722082，型号:WP700(MG-50037)，产品号:MG-5003TW，额定电压:220 V-50 HZ，输出功率:700W，微波输出功率:1050W，烧烤输出功率:950W，震荡频率:2450 MHZ］;METTLER AE240型十万分之一分析天平(瑞士METTLER);FA1004B电子天平(上海精密科学仪器有限公司);101型电热鼓风干燥箱(北京市永光明医疗仪器厂);KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);乙腈为色谱纯，水为超纯水。

沙苑子苷 A［5］、鼠李柠檬素对照品(自制，HPLC检测纯度＞99.0%，归一化法);沙苑子购于安徽泸谯中药饮片厂，经辽宁中医药大学药学院鉴定教研室翟延君教授鉴定为豆科植物扁茎黄芪(Astragalus complanatus R.Br.)的干燥成熟种子。

2 溶液制备

2.1 沙苑子及盐沙苑子的炮制 经初步筛选，确定沙苑子及盐沙苑子炮制工艺如下:

A生品:取净沙苑子50 g，粉碎，过60目筛，备用。

B清炒品:取净沙苑子50 g，置炒锅中，锅底温度120～130℃，炒制60 s，放凉，粉碎，过60目筛，备用。

C清水闷润炒干品:取净沙苑子50 g，加入20 mL清水至密闭容器内，闷润2 h，置炒锅中，锅底温度120～130℃，炒制60 s，放凉，粉碎，过60目筛，备用。

D盐水闷润炒干品:取净沙苑子50 g，加入20 mL盐水(含2%盐)至密闭容器内，闷润2 h，置炒锅中，锅底温度120～130℃，炒制60 s，放凉，粉碎，过60目筛，备用。

E盐水闷润烘干品:取净沙苑子50 g，加入20 mL盐水(含2%盐)至密闭容器内，闷润2 h，置于烘箱内，温度为60℃，烘干，4 h后取出，放凉，粉碎，过60目筛，备用。

F盐水闷润蒸后烘干品:取净沙苑子50 g，加入20 mL盐水(含2%盐)至密闭容器内，闷润2 h，取出，置于蒸锅中，圆气后蒸60 min后取出，置于烘箱内，温度为60℃，烘干，4 h后取出，放凉，粉碎，过60目筛，备用。

G盐水闷润蒸后炒干品:取净沙苑子50 g，加入20 mL盐水(含2%盐)至密闭容器内，闷润2 h，取出，置于蒸锅中，圆气后蒸60 min后取出，置于炒锅内，在锅底温度120～130℃下炒制60 s后取出，放凉，粉碎，过60目筛，备用。

H盐水闷润后微波品:取净沙苑子50 g，加入20 mL盐水(含2%盐)至密闭容器内，闷润2 h，取药置于微波炉内，高火微波6 min后取出，放凉，粉碎，过60目筛，备用。

2.2 对照品溶液的制备 取沙苑子苷A对照品0.00395 g，精密称定，置10 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度，从中精密量取1 mL置于50 mL量瓶中配制成每 1 mL 含沙苑子苷 A0.0079 mg［4］的对照品溶液;另精密称取鼠李柠檬素对照品0.00413 g，精密称定，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，从中精密量取1 mL置于50 mL量瓶中配制成每1 mL含鼠李柠檬素0.00826 mg的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备［4］取上述沙苑子生品及炮制品1 g，精密称定，置50 mL三角瓶中，精密加入石油醚(60～90℃)25 mL，密塞，超声30 min，静置，滤过，滤纸不弃;同法再次精密加入石油醚(60～90℃)25 mL，密塞，超声30 min，静置，用第一次的滤纸过滤，残渣挥干石油醚;连同滤纸一起放入三角瓶中，精密加入60%乙醇25 mL，密塞，称重，超声30 min，用60%乙醇补至原重，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

3 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱为 Agilent C18(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈-0.2%磷酸溶液(采用梯度洗脱的方式:0～12 min，20% ～24%乙腈;12～40 min，24% ～70%乙腈);流速为1.0 mL/min，检测波长为337 nm;沙苑子苷A和鼠李柠檬素的保留时间分别在10 min和30 min左右，且沙苑子苷A和鼠李柠檬素与相邻成分色谱峰的分离度都在1.5以上，理论塔板数均大于4000。

分别精密吸取沙苑子苷A对照品溶液、鼠李柠檬素对照品溶液与供试品溶液20 μL注入液相色谱仪，依上述色谱条件，测定，即得。HPLC图见图1。

4 线性关系考察

图1 对照品(A)及沙苑子供试品(B)的HPLC图

4.1 沙苑子苷A线性关系的考察 精密称定沙苑子苷A对照品0.00395 g，置10 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度，从中精密量取1 mL置于5 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度配制成0.0790 mg/mL沙苑子苷A 的对照品溶液，分别精密吸取 4、8、12、16、20 μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行分析，测定峰面积，绘制标准曲线。结果表明沙苑子苷A在0.3160 ～1.580 μg呈线性关系，其回归方程为 Y=112.14X+16.04，r=0.9999。

4.2 鼠李柠檬素线性关系的考察 精密称定鼠李柠檬素对照品0.00413 g，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，从中精密量取1 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度配制成0.0413 mg/mL鼠李柠檬素的对照品溶液，分别精密吸取 4、8、12、16、20 μL 注入液相色谱仪，测定峰面积，绘制标准曲线。结果表明鼠李柠檬素在 0.1652 ～0.8260 μg呈线性关系，其回归方程为 Y=99.005X-2.2，r=0.9997。

5 精密度试验

精密吸取沙苑子苷A和鼠李柠檬素的对照品溶液各20 μL连续进样6次，测定色谱峰面积。结果显示沙苑子苷A和鼠李柠檬素的RSD分别为1.2%和 1.4%。

6 重复性试验

精密称取沙苑子粉末1 g(过60目筛)，共6份，按2.3项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取20 μL注入液相色谱仪，测定色谱峰面积。结果显示沙苑子苷 A和鼠李柠檬素的 RSD分别为0.6%和1.5%，表明本试验测定方法的重复性良好。

7 稳定性试验

精密称取沙苑子粉末1 g(过60目筛)，按2.3项下方法制备供试品溶液，分别在 2、4、6、8、12 h 精密吸取20 μL注入液相色谱仪，测定色谱峰面积。结果显示沙苑子苷A和鼠李柠檬素的RSD分别为0.9%和1.4%。实验结果表明，在12 h内供试品溶液化学性质稳定。

8 加样回收率试验

精密称取已知含量(沙苑子苷A和鼠李柠檬素的含量分别为0.0967%，0.0340%)的同一沙苑子正品药材10 g，6份，分别精密加入沙苑子苷A对照品溶液(精密称取沙苑子苷A对照品11.00 mg，50%乙醇超声溶解并定容至10 mL，即得)2 mL、鼠李柠檬素溶液(精密称取鼠李柠檬素对照品12.00 mg，甲醇超声溶解并定容至10 mL，即得)2 mL，按2.3项下方法制备溶液，进行测定。结果平均回收率分别为 99.61%、98.98%;RSD 分别为 0.58%、1.28%。表明本法准确度符合要求，见表1。

表1 沙苑子苷A、鼠李柠檬素回收率试验结果(n=6)

9 样品含量测定

取上述沙苑子生品及炮制品粉末各1 g，精密称定，按上述色谱条件测定沙苑子苷A和鼠李柠檬素的含量，每个样品皆平行测定3次，以外标一点法计算含量，其平均值和RSD，结果见表2。

表2 沙苑子的含量测定结果

10 讨论

10.1 检测波长的选择 取沙苑子苷A对照品溶液和鼠李柠檬素对照品溶液进行紫外扫描，结果在266 nm及337 nm处均有最大吸收，但在337 nm波长下，干扰少，重现性好，故选择337 nm作为检测波长。

10.2 流动相的选择 实验过程中分别以乙腈-0.2%磷酸(20∶80)、乙腈-0.4%磷酸 (20∶80)、乙腈-0.2%磷酸(采用梯度洗脱的方式:0～12 min，20% ～24%乙腈;12～40 min，24% ～70%乙腈)为流动相进行了比较，结果以乙腈-0.2%磷酸(采用梯度洗脱的方式:0～12 min，20% ～24%乙腈;12～40 min，24% ～70%乙腈)为流动相所得峰形较好，分离度高，故选之。

10.3 方法的选择 沙苑子种子中含油脂量高，需进行脱脂处理，试验中筛选了石油醚(30～60℃)、石油醚(60～90℃)和乙醚3种试剂，结果发现用石油醚(60～90℃)超声处理既有良好的脱脂效果，又能保留目标成分。实验过程中还对供试品溶液的其他提取方法进行了考察，最终确定了前述提取方法。

10.4 沙苑子苷A和鼠李柠檬素为苷和苷元的关系，沙苑子生品中沙苑子苷A的含量远高于鼠李柠檬素的含量;炮制品中两者的含量变化皆不大，其中盐炙沙苑子中沙苑子苷A和鼠李柠檬素的含量最高，分析其原因主要为在炮制加热过程中酶解沙苑子苷A的自生酶被破坏，即“杀酶保苷”原理。而此酶在何种条件下完全失效以保苷以及何种条件下此酶活性最强以利用其苷元的抗肿瘤的作用，有待进一步的研究。

［1］中国药典［S］.一部.2005:127.

［2］刘春宇，顾振纶.沙苑子的化学成分和药理作用［J］.中国野生植物资源，2002，21(2):1.

［3］张建军，闫兴丽，张玉杰，等.HPLC测定沙苑子中沙苑子苷A的含量［J］.中国中药杂志，2005，30(8):600.

［4］甄汉深，周燕园，袁叶飞，等.青天葵中黄酮类化合物的体外抗肿瘤实验研究［J］.中国实验方剂学杂志，2008，14(3):36.

［5］Cui Baoliang，Nakamura M，Kinjo J.Chemical Constituents of Astragali Semen［J］.Chem Pharm Bull，1993，41(1):178.