乙型肝炎病毒表面抗原弱反应性结果的确认

吴 斌

（岳阳市中心血站检验科，湖南岳阳414000）

在乙型肝炎病毒感染人群中，部分患者血清乙肝表面抗原(HBsAg)呈低水平表达，随着检测技术不断改进，HBsAg弱反应性结果的比率也在升高[1]，但不同方法、不同试剂检测血清HBsAg，弱反应性结果有较大差异[2-3]。为此，我们探讨采用同一厂家试剂用中和法对HBsAg弱反应性结果进行确认。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

1.1.1 WELLSCAN K3酶标仪、anthos fluido洗板机、ARCHITECT i2000 SR全自动免疫分析仪，分别是上海雷勃公司、郑州安图生物工程公司、美国雅培公司产品。

1.1.2 ELISA法检测HBsAg诊断试剂盒购自山东潍坊三维生物工程集团有限公司，批号：20080501；MEIA法HBsAg诊断试剂盒购自美国雅培公司，批号：53518HNOO。

1.1.3 4IU/mL的HBsAg参比血清由卫生部临床检验中心提供，批号：GBW(E)090042。

1.1.4 待确认血清 2006年11月～2008年6月间本实验室用ELISA法检测血清HBsAg，初检结果S/CO值界于1～4的标本；收集血清-40℃保存备检。

1.1.5 阴性对照血清收集 收集2008年6～8月本室使用的山东潍坊三维生物工程集团有限公司HB-sAg ELISA法诊断试剂剩余阴性对照血清，4℃保存，使用前混合均匀。

1.1.6 抗-HBs抗体阳性血清(下称”抗-HBs血清“)收集

收集本实验室检测乙肝病毒五项标志物，抗-HBs抗体强阳性(抗-HBs抗体S/CO值大于20)的标本剩余血清，收集期间4℃保存(五天为一个收集周期)；收集结束将所有血清混合均匀，用ELISA法再次检测，结果抗-HBs抗体强阳性 (抗-HBs抗体S/CO值大于20)，HBsAg及HBeAg阴性；用实时荧光PCR法测定HBV-DNA，结果＜1000copies/mL。完成后-40℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 抗-HBs抗体阳性血清中和法确认187份HB-sAg待确认血清，每份血清均设样本对照和样本确认，按试剂盒操作说明书进行，临界值(CO)=2.1×N。

确认实验操作步骤如下：

?

结果判断：⑴样本对照S/CO值＞1，且（样本确认S/CO值/样本对照S/CO值）×100%＜50%被认为确认试验阳性；⑵样本对照S/CO值、样本确认S/CO值均小于1，或 样本对照S/CO值＞1，但 （样本确认S/CO值/样本对照S/CO值）×100%＞50%，均被认为确认试验阴性。⑶样本对照S/CO值＞18，（样本确认S/CO值/样本对照S/CO值）×100%＞50%时，需要对标本稀释后再确认。

1.2.2 灵敏度 将4IU/mL的HBsAg参比血清用阴性对照血清精确稀释为 1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5IU/mL 系列浓度血清， 每个稀释度3份，用1.2.1确认法检测0.5～1.5 IU/mL共11个系列浓度33份血清,求各稀释度S/CO值的均值,后按1.2.1结果判断方法判断确认结果，判断为确认试验阳性的HBsAg最低浓度被认为是该方法的最低确认限(灵敏度)。

1.2.3 重复性 将数份确认阳性的血清混合,制成S/CO大约为1.2的混合血清,用1.2.1确认法每天检测1次,共测 20天,然后计算其均值(mean)、标准差(SD)、变异系数(CV)。

1.2.4 Abbott MEIA法对照检测试验 从抗-HBs抗体阳性血清中和法确认为阳性的165份血清中随机抽取22份及确认为阴性的全部22份血清用MEIA法检测，检测步骤严格按操作说明书进行。

2 结果

2.1 抗-HBs抗体阳性血清中和法确认187份HB-sAg待确认血清，有165份确认试验阳性，22份确认试验阴性。确认试验阳性的165份血清，其”(样本确认S/CO值/样本对照S/CO值)×100%“值在10%～40%之间。确认结果阴性的22份血清中，有14份样本对照S/CO值小于1，另8份样本对照S/CO值1.4～2.6,但其”(样本确认 S/CO 值/样本对照 S/CO 值)×100%“值在78.16%～90.34%之间。

2.2 采用抗-HBs抗体阳性血清中和法确认HBsAg系列浓度血清，最低确认限（灵敏度）为1.1IU/mL。

2.3 重复性检测结果见表1。

表1 对混合血清检测的精密度(重复性)结果(n=20)

2.4 44份用Abbott MEIA法对照检测的血清，结果为22份阳性、22份阴性,与抗-HBs抗体阳性血清中和法确认结果一致。

3 讨论

乙肝表面抗原检测，灰值区结果的准确性问题一直困扰着检验医学工作者。近年来，抗病毒药物在临床广泛应用，乙肝表面抗原弱反应性结果的比率也在随之增高，乙肝表面抗原假有反应性结果对被检者造成巨大的负面影响，而假阴性结果又会造成临床误判，延误患者病情，这些情况都要求对乙肝表面抗原进行确认。确认试验阳性临界点的设定[4]，ELISA法检测HBsAg结果S/CO值允许有一定的变异，为了减少重复测定中实验误差对确认试验结果判断的影响，确认试验阳性临界点应尽可能地远离允许误差；但各种干扰因素对ELISA法检测HBsAg结果的影响也较大，尤其是弱反应性结果。所以，将”样本确认与样本对照比较，S/CO值被中和下降50%“设定为确认试验阳性的临界点。

混合血清可以增加抗-HBs抗体相对于HBsAg抗原血清型的多样性，从而能够适用于中和多种血清型的HBsAg抗原，并且混合血清可以相互稀释单份血清中的干扰物质，而减小干扰物质对确认试验的干扰作用。有研究报道[5]，ELISA法检测HBsAg分步法操作，可以避免检测试剂对待测成分的稀释，从而提高了方法的灵敏度，同时避免因检测试剂中的酶标记抗-HBs抗体相对过剩产生的免疫封蔽效应，并且因为洗板后再加入酶标记抗-HBs抗体而避免了因待测成分过剩产生HOOK效应，以及避免了部分内源性干扰物的干扰。不同方法、不同试剂对照检测，乙肝表面抗原弱反应性标本的结果也有较大出入[2-3]。该确认方法采用同一厂家试剂，避免了使用不同厂家试剂进行确认因试剂灵敏度差异而造成的假阴性。

上述实验结果表明，抗-HBs抗体阳性血清中和法确认HBsAg结果可靠，灵敏度高，重复性好，可以用于HBsAg的确认，且操作简单、经济、实用，能在各级医疗机构推广应用。

[1]陈瑜,钟步云,徐根云,等.低水平血清乙肝病毒表面抗原测定及其临床意义[J].中华检验医学杂志,2001,24(01):38-40.[2]成军,孙长贵,谢珏,等.3种方法4种试剂检测HBV血清标志物结果比较[J].临床检验杂志,2006,24(02):144-145.

[3]王良华,邬旭群,鲍自谦,等.不同ELISA试剂HBsAg初复检结果的比较[J].中国输血杂志,2007,20(02):124-125.

[4]雷震,谢南.抗-HBs抗体阳性血清中和确认HBsAg方法的建立[J].实验与检验医学,2008,26(6):677-678

[5]雷震,谢楠,敖琴芳,等.加酶时间对ELISA定性测定HBsAg的影响[J].现代检验医学杂志,2007,22(05):20-22.