芹菜素增强TRAIL诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡

刘杰 ，唐爱琼 ，刘飞 ，曹建国 ，陈忠东 ⋆

（1.南华大学第一附属医院，湖南 衡阳 421001；2.湖南师范大学医学院，湖南 长沙，410013）

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是目前发现的唯一能够选择性诱导癌细胞和恶性转化细胞凋亡，对正常组织细胞细胞毒性微弱的内源性细胞因子[1]。芹菜素(apiginin,API)是一种广泛存在于多种水果和蔬菜中的黄酮类化合物，具有体内外肿瘤预防作用[2]。本文旨在研究API与TRAIL合用对人宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂 芹菜素(apigenin,API)由美国Sigma公司出品；重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)由英国PeproTech公司生产；碘化丙啶（PI）由美国英杰生物技术公司出品；DNA Ladder检测凋亡试剂盒购于北京博大泰克生物基因技术有限公司。

1.2 细胞培养 人宫颈癌HeLa细胞购于中国典型培养物保藏中心(中国武汉市)，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基，加100U/mL青霉素，100U/mL链霉素，置于37℃，5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 流式细胞术分析 取对数生长期HeLa细胞，培养24h待细胞贴壁，用含0.1%的小牛血清的培养基处理24h进行细胞周期同步化后，分别加入含标示终浓度受试物的完全培养基作用48h；0.1%DMSO作为溶媒对照。0.25%胰蛋白酶消化，收集所有细胞于1.5mL EP管中，用4℃的75%乙醇固定24h后，经碘化丙啶（PI）染色，用流式细胞仪测定细胞DNA含量。以上实验重复2次。

1.4 DNA琼脂糖凝胶电泳 取对数生长期HeLa细胞，分别加入含标示终浓度受试物的完全培养基作用48h；0.1%DMSO作为溶媒对照。细胞收集于1.5mL EP管中用于提取DNA。按北京博大泰克生物基因技术有限公司凋亡细胞DNA ladder检测试剂盒说明书步骤分别提取DNA，置于4℃冰箱过夜。再将提取的DNA样品5μL与6×Buffer 1μL混匀后，加到1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，最后在Alphaimager TM 2200凝胶图像分析系统观察并摄影。以上实验重复2次。

1.5 统计学分析 实验数据录入Spss 15.0 for windows evaluation软件，建立数据库，各组实验数据均用均数±标准差表示，用One Way ANOVA行方差分析。P＜0.05为统计学意义显著标准。

2 结果

2.1 芹菜素、TRAIL及两者合用对人宫颈癌HeLa细胞Sub-G1百分率影响

PI染色FCM分析结果发现：API(20μmol/L)和TRAIL(20ng/mL)以及两者合用的人宫颈癌HeLa细胞 sub-G1百分率分别是 3.56%±0.20%、6.69%±0.40%和59.8%±4.20%。两者合用的sub-G1细胞百分率是API(20μmol/L)与TRAIL(20ng/mL)单独使用是sub-G1细胞百分率之和的583%(P＜0.05,图1)。提示，亚细胞毒性浓度的API能够有效促进TRAIL导致人宫颈HeLa细胞凋亡。

图1 亚细胞毒性浓度的API和TRAIL两者合用对HeLa细胞sub-G1百分率的影响

2.2 芹菜素、TRAIL及两者合用对人宫颈癌HeLa细胞DNA核小体间断裂的影响

DNA琼脂糖凝胶电泳显示：单用芹菜素20μmol/L或 TRAIL20 ng/mL孵育 HeLa细胞 48h，未见典型DNA梯形条带(图2)；然而，用20μmol/L的芹菜素预孵育4h，再加入20 ng/mL的TRAIL处理44h，展示出典型DNA梯形条带图谱(图2)。证实：亚细胞毒性浓度的芹菜素具有显著增强TRAIL诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡作用。

3 讨论

图3 亚细胞毒性浓度的芹菜素、TRAIL及两者合用对人宫颈癌HeLa细胞DNA梯形条带的影响

最近，朱琳等[3]检测了宫颈癌细胞HeLa表面TRAIL死亡受体 (DR4、DR5)及诱饵受体(DcR1、DcR2)的表达差异,结果表明,HeLa表面DR4、DR5受体mRNA的表达明显高于DcR1、DcR2受体。Ryu等[4]用Western blotting检测TRAIL受体在宫颈癌与正常宫颈组织中的表达,实验表明在正常宫颈组织中诱骗受体及死亡受体均有表达,而在宫颈癌中死亡受体的表达高于诱骗受体,这与正常细胞逃逸TRAIL诱导的凋亡机制一致。并且,TRAIL在宫颈癌组织中诱导肿瘤细胞凋亡的过程不依赖于P53。 因此，TRA IL的发现给肿瘤包括宫颈癌的治疗带来了希望。目前的以及已经集中在如何提高TRAIL在不敏感肿瘤细胞系的敏感性？

有研究表明，芹菜素具有促进人胃癌BGC-823细胞凋亡作用，呈浓度依赖性。芹菜素主要通过活化线粒体途径诱导BGC-823凋亡[5]。芹菜素还可诱导人宫颈癌细胞HeLa的G1期阻滞和细胞凋亡，这与细胞 p21/WAF1、Fas/APO-1、caspase-3 的表达增加，以及Bcl-2表达减少有关[6]。最近，Horinaka报道：芹菜素通过上调DR5增强TRAIL诱导人白血病细胞、人前列腺癌细胞和人结肠癌细胞凋亡作用[7]。因此，本文研究的主要目的是观察芹菜素增强TRAIL诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡作用。

本文首先采用PI染色FCM分析芹菜素、TRAIL、以及两者合用对HeLa细胞sub-G1百分率的影响。结果发现：API(20μmol/L)和TRAIL(20ng/mL)以及两者合用的HeLa细胞sub-G1百分率分别 是 3.56%±0.20%、6.69%±0.40%和 59.87%±4.20%。提示，亚细胞毒性浓度的API能够有效促进TRAIL导致人宫颈癌HeLa细胞凋亡。

细胞凋亡的另一个主要生物化学特征是凋亡的细胞DNA发生非随机性的核小体间剪切，在琼脂糖凝胶电泳中呈现出典型DNA梯形条带。为了确证芹菜素对TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的增敏作用，我们用DNA琼脂糖凝胶电泳检测芹菜素、TRAIL及两者联合对人宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响。结果显示：用20μmol/L的芹菜素预孵育4h，再加入20 ng/mL的TRAIL处理44h，展示出典型DNA梯形条带图谱(图2)。证实亚细胞毒性浓度的芹菜素具有显著增强TRAIL诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡作用。

总之，本文的研究结论是无基因毒性的黄酮类化合物芹菜素在亚细胞毒性浓度下能够显著增强TRAIL诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡作用。本文的以及结果彰显了联合应用芹菜素和TRAIL是有希望的治疗人宫颈癌的新型方案的特性。

[1]Zhang T,Wu M,Chen Q,et al Z.Investigation into the regulation mechanisms of TRAIL apoptosis pathway by mathematical modeling[J].Acta Biochim Biophys Sin，2010，42(2):98-108.

[2]Tsai CH,Lin FM,Yang YC,et al.Herbal extract of Wedelia chinensis attenuates androgen receptor activity and orthotopic growth of prostate cancer in nude mice[J].Clin Cancer Res， 2009， 15(17):5435-54~44.

[3]朱琳,李慧荣,吴建,等.宫颈癌细胞TRAIL死亡受体和诱骗受体表达的研究[J].现代妇产科进展,2005,14(4):277-280.

[4]Ryu HS,Chang KH.Expression of TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)receptors in cervical cancer.[J].Int J Gynecol Cancer,2000,10(5):417-424.

[5]胡太平,曹建国.芹菜素诱导人胃癌细胞凋亡作用及机制研究 [J].国际病理科学与临床杂志,2007,27(10):6-10.

[6]Zheng PW,Chiang LC,Lin CC.Apigenin induced apoptosis through p53-dependent pathway in human cervical carcinoma cells[J].Life Sci,2005,76(12):1367-1379.

[7]Horinaka M,Yoshida T,Shiraishi T,Nakata S,Wakada M,Sakai T.The dietary flavonoid apigenin sensitizes malignant tumor cells to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand[J].Mol Cancer Ther,2006，5(4):945-951.