AFLP标记检测大足黑山羊地方类群遗传多样性的研究

杨国锋 ，孙 娟 ，张家骅

（1.西南大学动物科学技术学院，重庆 400716；2.青岛农业大学生命科学学院，山东 青岛 266109；3.青岛农业大学动物科学技术学院，山东 青岛 266109）

AFLP是1993年由荷兰科学家Zabeau和Vos建立的一种检测DNA多态性的方法，结合了RFLP和RAPD的优点，既具有RFLP标记的专一性、可靠性，又具有RAPD标记的随机性、方便性。该技术自1995年报道以来，以较好的稳定性和较高的多态检出率而受到分子生物学家的关注，并得到了广泛应用。

1 材料与方法

1.1 样品的采集 血样采自重庆市大足县某羊场。

1.2 试剂 TaqDNA聚合酶、dNTPs、T4DNA连接酶、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵、尿素、亲和硅烷、剥离硅烷、引物为北京鼎国产品；TaqⅠ、EcoRⅠ酶为Promega公司产品。接头、引物序列见表1。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取 采用常规的苯酚-氯仿法。

1.3.2 接头的准备 EcoRⅠ和TaqⅠ接头浓度分别为5pM和50pM。

1.3.3 基因组DNA的酶切和接头的连接 酶切：DNA 0.5μg、EcoRⅠ5 U、TaqⅠ5 U、5×R/L buffer 3μL，加ddH2O 至 15μL；离心，37℃孵化 2～3 h，70℃孵化15min，使内切酶失活。连接：加入混合液（EcoRⅠ接头 1 μL、TaqⅠ接头 1μL、5×R/L buffer 2μL、T4 DNA ligase 2 U、ATP 1mM，加 ddH2O 至 10μL），37℃孵化8 h或过夜。0.8%琼脂糖凝胶检测，用TE0.1溶液将产物按1∶10比例稀释，-20℃保存。

表1 AFLP接头、预扩增、扩增引物序列

1.3.4 限制性片段预扩增 引物为50ng/μL，预扩增体系：EcoRⅠ+A、TaqⅠ+A/C 各 1.5μL、dNTPs 0.2mM、Taq 酶 1.5U、10×PCR buffer（含 Mg2+）5 μL、稀释产物5μL，用ddH2O补足50μL。PCR扩增条件：94℃ 2min；94℃ 60 s，56℃ 60 s，72℃ 60 s，共 26 个循环；72℃5min，4℃保存。0.8%琼脂糖凝胶检测，用TE0.1将产物按1∶10比例稀释，-20℃保存。

1.3.5 限制性片段选择性扩增 扩增体系：EcoRⅠ、TaqⅠ引物各1.5μL，其余同上（限制性片段预扩增），PCR 扩增条件：94℃ 2min；94℃ 30s，65℃ 30 s，72℃60 s（以后每个循环的退火温度降0.7℃），共13个循环，接着94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s，共23个循环；72℃ 2min，4℃保存。扩增后，取5μL选择性扩增产物，加5μL上样缓冲液，95℃变性3min，冰浴冷却，备用。

1.3.6 电泳 琼脂糖凝胶电泳后，采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染，扫描成像。

2 结果与分析

2.1 琼脂糖电泳检测结果 DNA条带致密整齐，无拖尾，所得基因组无降解；总DNA分子量大小在50kb以上；所测样品OD260/OD280在1.8左右，说明蛋白质和DNA提取过程中的其他残留较少。酶切基因组DNA的主带消失，呈梯度模糊状，说明酶切充分，达到实验要求。预扩增和选择性扩增产物，无拖带，扩增产物效果良好。

2.2 变性聚丙烯酰胺检测结果 从15对引物中筛选，有11对引物扩增效果较好，扩增出了766个条带，平均每对引物扩增出69.6个条带，其中发现59条多态条带，平均多态率为5.36%，结果见表2。

3 分析讨论

3.1 关于实验条件

表2 11对引物组合的遗传多样性

3.1.1 高质量DNA样品的准备 高质量DNA样品至少具备以下特性：分子量高，在DNA的提取过程中，为防止DNA断裂，振荡一定要柔和；纯度高，不能含抑制限制性内切酶活性的物质，否则将使随后的DNA酶切不完全，应注意避免核酸酶、其他DNA污染和抑制物质的存在。

3.1.2 限制性核酸内切酶的选择 常采用两种限制性内切酶，一种酶的识别位点为4个碱基，可以产生小片段DNA便于扩增，另一种为6个碱基，可控制扩增片段的数量。EcoRⅠ可靠、高效而价廉，是六碱基内切酶的首选酶类；而四碱基内切酶在分析植物和微生物基因组时大多选用MseⅠ，分析动物基因组时常用TaqⅠ。Msp和Hinp识别序列（CCGC，GCGC）含有GC双碱基序列，因此也可以替代TaqⅠ使用。

3.1.3 关于银染 银染过程中，水质很重要，应保证水的纯净和容器的洁净。季节对银染效果也有影响，银染效果以夏秋季节较好，冬季染色效果不良。加甲醛使Ag2+还原成银颗粒，应待硝酸银充分溶解并摇匀后，再将玻璃板放入，否则会造成背景杂乱。显影时间过短，则显影不充分，谱带模糊；过长，胶板上部大分子量片段被背景遮盖，影响结果统计，要在主要带纹出现后立即定影，一般5～8min左右即可充分显影。显影液温度可适当低一些，这样可降低背景颜色，但不可过低，否则会使显色时间延长，影响实验效果。

3.2 关于多态性 平均多态率仅5.36%，较低，原因有：个体间亲缘关系近，碱基差异小；扩增条带多集中于凝胶上部，其分子量较大，碱基的差异不易检测。显色往往是自上而下，上下显影相差1～2min，时间不同步就会造成小片段不能完全显色。因此，多态条带集中在一定区域，本实验差异片段主要集中在150bp～600bp之间。

[1]Pieter V，Rene H，et al.AFLP：a new technique for DNA fingerprinting[J].Nucleic Acids Res.，1995，21：4407-4414.

[2]朱文进，曹瑞琴，张纪刚，等.分子标记AFLP及其在遗传分析中的应用 [J].动物科学与动物医学，2001，19（5）：21-23.