益气活血中药对血管生成PI3K和MAPK信号途径的影响1)

王培利,雷 燕,王承龙

近来研究发现磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)与血管平滑肌细胞的增殖密切相关[1,2],并且PI3K信号途径在介导人肺血管平滑肌细胞的增殖和迁移中起重要作用[3]。低氧可以激活肿瘤细胞中的PI3K途径而调节细胞的增殖与凋亡[4]。但在缺血心肌中PI3K表达如何还未见报道。Akt又称蛋白激酶B(proteinkinase B,PKB),是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。Akt是细胞生存的关键因子。多种生长因子主要通过PI3K/Akt信号转导通路而发挥作用。激活后的Akt主要通过对含有丝氨酸/苏氨酸残基的底物磷酸化而发挥广泛的生物学效应,包括抗凋亡、促细胞生存和增殖功能。同时,PI3K活化后可以直接调节促分裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase,MAPK)途径,其中包括ERK途径和JNK途径。当归补血汤具有促进缺血心肌大鼠血管生成作用[5,6]。本实验探讨了当归补血汤对心肌缺血后PI 3K、Akt/PKB、MAPK信号转导途径的影响,以期明确当归补血汤促进血管新生的信号转导机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 Folin酚(北京鼎国生物技术公司产品),丙烯酰胺、甘氨酸(Promega),硝酸四氮唑蓝(NBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP),硝酸纤维素膜(Gelman公司)。蛋白质电泳用第二抗体:碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体(北京中杉金桥公司)。T ris base、十二烷基硫酸钠,过硫酸铵,溴酚蓝,胰蛋白酶,乙二胺四乙酸,1 mM苯甲基磺酰氟,0.1%抑蛋白酶肽(Sigma)。PI3K及Akt单克隆抗体试剂盒购自北京宣武医院多肽实验室。p38丝裂素活化蛋白激酶活性测定试剂盒(Cell Signaling)。血管内皮生长因子(VEGF),购自武汉博士德生物工程有限公司;

1.2 主要仪器 紫外/可见光光度仪Lamda-Bio(美国PE公司),电动匀浆器 DIAX900(德国Heidolph公司),转移电泳仪DYY-Ⅲ(北京六一仪器厂),稳压稳流电泳仪 DYY-Ⅲ(北京医疗设备厂),低温离心机Microfuge R(BECKMAN),万向脱色摇床TS-920(北京新技术应用研究所)。Image Pro Plus 4.0图像分析系统,OLYMPUS生产。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物 Wistar雄性大鼠(中国医学科学院实验动物研究所,许可证:SCX京2000-0006),体重180 g～220 g。

1.3.2 实验药物 当归补血汤中黄芪Astragalus membranaceus(Fisch)Bunge、当归 Angelica sinensis(Oliv)Diels,均系干品,由中国中医研究院中药所鉴定为正品。黄芪、当归按5∶1比例合煎,并浓缩至含生药1 g/mL,4℃保存备用,大、中、小剂量分别为1.2 g/100(g◦d)、0.6 g/100(g◦ d)、0.3 g/100(g◦d)。倍他乐克:阿斯利康制药有限公司,批准文号:国药准字H32025390,批号200311002,每只大鼠给药2.5mg/100(g◦d)。

1.3.3 心肌梗死大鼠的制备 采用冠脉结扎法,术后腹腔内注射青霉素钠8×105U/d,连续3 d抗感染。造模成功大鼠随机分成正常组、模型组、倍他乐克组、当归补血汤大剂量组、当归补血汤中剂量组、当归补血汤小剂量组。用药组灌服当归补血汤煎剂和倍它乐克水溶液,其他组灌服生理盐水,均为2周。

1.3.4 免疫组化技术测定左室梗死边缘区VEGF表达量 心肌组织切片经脱蜡至水 ,3%H2O2灭活内源性过氧化酶 ,枸橼酸缓冲液热修复,0.01M PBS缓冲液洗涤 ,山羊血清封闭液封闭,一抗孵育4℃过夜,0.01M PBS缓冲液洗涤,二抗孵育,0.01M PBS缓冲液洗涤,SABC试剂孵育,光学显微镜下观察心肌微血管特异性显色。采用Image Pro Plus 4.0图像分析软件采集数据,计算阳性区域所占总面积。

1.3.5 蛋白定量 两周后麻醉取材。切下梗死边缘区;将其置于eppendorf管中加入预冷的 0.01M PBS液洗涤2次;按照1∶5加入预冷组织裂解液,Folin酚法定量蛋白;分装上清,于-70℃保存。

1.3.6 Western免疫印迹方法 应用微量加样器加入25 μ L样品,第一抗,置于摇床上摇动,室温下 2 h。倾去一抗,PBS洗膜3次,每次10 min。加入1∶2 000碱性磷酸酶标记的羊抗鼠,置于摇床上,室温下 2 h。弃去二抗,PBS洗膜3次,每次10 min。加入显色缓冲液,室温下染色,观察到有蓝色条带出现后,用蒸馏水冲洗终止反应。

1.4 统计学处理 采用SPSS 11.0软件包进行统计。采用方差分析。

2 结 果

2.1 当归补血汤对左室梗死边缘区VEGF表达量的影响 模型组的左室梗死边缘区VEGF阳性面积明显高于对照组(P＜0.05),其他各治疗组也有不同程度的升高,而且较模型组更高。其中倍他乐克组和当归补血汤小剂量组最为显著(P＜0.05)。详见图1。

表1 当归补血汤对左室梗死边缘区VEGF表达量和Ⅷ因子血管密度的影响

2.2 PI3K蛋白的表达 除对照组未见表达外,其余各组均有不同程度的PI3K蛋白的表达,其中倍他乐克组和当归补血汤中剂量组表达最为明显,而模型组和当归补血汤大剂量组以及小剂量组表达较少,条带灰度最弱。说明本缺氧模型具有较弱促进PI3K表达的作用,而倍他乐克和中药则可能促进PI3K的表达。详见图1、图2。

2.3 Akt蛋白的表达 各组均有不同程度的Akt蛋白表达,其中对照组最少。模型组也有适量的表达,倍他乐克组和当归补血汤中剂量组较为明显。缺氧诱导通过Akt途径,而药物也可能通过该途径发挥作用。详见图3、图4。

图3 各组AKT蛋白表达条带

图4 Akt Western印迹信号强度灰度分析

2.4 p38 MAPK蛋白的表达 各组均有不同程度的p38 M APK蛋白表达,当归补血汤大剂量组、衰老组以及倍他乐克组表达较少。心梗应激因素可激活MAPK信号转导途径,当归补血汤的作用有剂量差别,随着剂量增加,激活p38M APK蛋白表达的作用有所减弱。详见图 5、图6。

3 讨 论

血管生成和信号转导机制同为当前两大热点研究领域。近年来在促血管生成的介导因子及其在血管内皮细胞中的信号转导机制等方面的研究取得了重要进展。

目前,血管生成研究主要涉及肿瘤和心血管两个学科领域,尤其在肿瘤方面,研究非常深入。肿瘤血管生成致病机制较为成熟,对信号转导机制研究也较为清晰,其中MAPK家族被认为是血管生成信号通路的重要成员,具有调节细胞生长与分化等不同的功能。而在心血管疾病尤其心肌缺血方面的信号转导机制却鲜有研究,尤其益气活血中药改善缺血心肌功能、促进血管新生的信号转导机制更少有报道。

M APK家族主要分为三个亚类:ERKl/2、JNK以及p38MAPK。ERKl/2信号通路被生长因子活化[7];而JNK通路和p38/HOG-1通路,是由紫外线、渗透压变化、细胞因子(IL-1)、TNF和生理应激而激活[8],统称MAPK应激信号通路。以前大量的研究证实 VEGF、FGF、PDGF、EGF等细胞因子主要通过丝裂原活化的蛋白激酶信号途径介导细胞增殖。但越来越多的研究发现,低氧诱导产生的许多生长因子可通过PI3K途径介导血管平滑肌细胞(VSMC)增殖,并且MAPK可作为PI3K下游的靶分子,通过PI3K/MAPK途径调节细胞增殖。

PI3K是许多生命活动中关键的信号分子,PI3K介导的信号转导通路调节细胞的分裂、分化、凋亡等活动[9,10]。当生长因子与细胞膜受体结合后激活PI3K,磷酸化细胞膜上肌醇环中第3位轻基产生3-PIP、3,4-PIP2和3,4,5-PIP3,这些产物可作为第二信使作用于其下游的N与细胞生长密切相关的蛋白或激酶,如Akt,最终活化和上调cyclinD1引起细胞增殖[11,12]。

Akt参与由生长因子激活的经P13K介导的信号转导过程日益受到关注。PKB的表达可以在缺血区域诱导产生新生血管,近来也表明其能够维持受损心肌组织的完整性,介导信号转导途径[13,14]。

Akt是PI3K下游直接的靶蛋白。PDGF等多种生长因子都能通过PDGF受体上酪氨酸(Y740/Y751)位点磷酸化后产生与PI3K的p85亚基结合的高亲和位点,诱导PKB的激活。此外,由于PI3K的p110亚基也可直接与小分子GTP酶Ras相互作用,活化的Ras也可通过 PI3K部分激活 PKB。PKB还可通过细胞核内信号转导通路直接作用于核转录因子CREB,引起特定基因的表达。PI3K激活的PKB可以介导多种生长因子如PDGF、EGF、胰岛素、凝血酶 dGF-1及NGF等所诱发的细胞生长[15]。

本实验结果表明,益气活血中药当归补血汤能够促进缺血区域VEGF的表达;同时不同程度促进PI3K的表达,较模型组与倍他乐克组具有明显优势。通过对PI3K的促表达作用,从而进一步启动了下游信号途径的激活。倍它乐克组和当归补血汤中剂量组较为明显促进Akt蛋白的表达,模型组、当归补血汤小剂量组却明显激活MAPK蛋白表达。通过以上途径,最终使得缺血区域心肌的VEGF蛋白表达增强,产生缺血区域血管生成作用。这表明益气活血中药从不同途径进行了抗缺血缺氧及促血管生成的作用。

同时缺血缺氧也是一个重要的信号启动机制,实验中显示其作用较为明显。已经证实益气活血药物具有提高人体免疫力,增强自我修复能力的作用。本课题组前期研究也表明,益气活血中药当归补血汤能够改善心肌缺血,促进血管生成。在缺血缺氧的刺激下,心肌细胞、血管内皮细胞遭受到了破坏,机体启动保护机制,通过促进细胞增加、血管增加来改善损害,但局部而应急的反应不能挽救大面积的损伤。益气活血药物通过调节细胞信号转导机制,启动生长、增殖信号,促进新生血管生成,增强了机体抗修复能力,可望配合应对超过自我修复能力的损伤。新的血管生成因子及其信号转导机制的研究不仅是发育生物学和细胞生物学的基础课题,更具有重要的临床意义,可以说人类多数疾病都与血液循环和新血管生成有关。然而,血管生成的促进和抑制,是否会影响肿瘤的消长,同时又是否影响缺血心肌侧支的成熟,这仍是研究的难点。虽然这些研究还比较浅显,但进展很快,必将为多种疾病的有效治疗提供一些新的思路。

[1]Jung F,Haendeler,Goebel,et al.Growth factor-induced phosphoinositide 3-OH kinase/Akt phosphorylation in smooth muscle cells:Induction of cell proliferation and inhibition of cell death[J].Cardiovasc Res,2000,48(1):148-157.

[2]Bacqueville D,Iklleras P,Nbndre C,et al.Characterization of a G protein-activated phosphoinositide 3-kinase in vas cular smooth muscle cell nuclei[J].J Biol Chem,2001,276(25):22170-22176.

[3]Goncharova EA,Ammit AJ,Irani C,et al.PI3K is required for proliferation and mig ration of human pulmonary vascular smooth muscle cell[J].Am J Physiol,2002,283(2):L354-L363.

[4]Chen EY,Mazure NM,Cooper JA,et al.Hypoxia activates a platelet-derived growth factor receptor/phosphloinositide 3-kinase/Akt pathway that results in glycogen synthase kinase-3 inactivation[J].Cancer Res,2001,61(6):2429-2433.

[5]雷燕,王培利,林燕林,等.当归补血汤煎剂对实验性心肌梗死衰老大鼠缺血心肌的促血管生成作用[J].中国中医基础医学杂志,2005,11(12):892-894.

[6]王培利,雷燕,林燕林,等.当归补血汤含药血清对培养内皮细胞生长因子受体表达的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2006,4(3):209-212.

[7]Mavria G,Vercoulen Y,Yeo M,et al.ERK-MAPK signaling opposes Rho-kinase to promote endothelial cell survival and sprouting during angiogenesis[J].Cancer Cell,2006,9(1):33-44.

[8]Silfani FN,Freeman EJ.Phosphloinositide 3-kinase regulates angiotensin 11-induced cytosolic phospholipase A2 activity and growth in vascular smooth muscle cells[J].Arch Biochem Biophys,2002,402(1):84-93.

[9]Shiojima I,Walsh K.Role of Akt signaling in vascular homeostasis and angiogenesis[J].Circ Res,2002,90:1243-1250.

[10]Douglas W,Losordo MD,Stefanie Dimmeler PhD.T herapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease PartⅠ:Angiogenesis cytokines[J].Circulation,2004(1):2487-2491.

[11]Hirst SJ,Walker T R,Chilvers ER.Phenotypic diversity and molecular mechanisms of airway smooth muscle proliferation in asthma[J].Fur Respir J,2000,16(1):159-177.

[12]Namkoong S,Kim CK,Cho YL,et al.Forskolin increases angiogenesis through the coordinated cross-talk of PKA-dependent VEGF expression and Epac-mediated PI3K/A kt/eNOS signaling[J].Cell Sig nal,2009,21(6):906-915.

[13]Shiojima I,Walsh K.Role of Akt signaling in vascular homeostasis and angiogenesis[J].Circ Res,2002,90:1243-1250.

[14]Jiang BH,Liu LZ.AKT signaling in regulating angiogenesis[J].Curr Cancer Drug Targets,2008,8(1):19-26.

[15]Liu L,Zhu S,Gong Z,et al.K-ras/PI3K-Akt signaling is essential for zebrafish hematopoiesis and angiogenesis[J].PLoS One,2008,3(8):2850.