冷冻温度对牛精子复苏率及降温速率变化规律的研究

邓福金,吴庆荣,王化青

(1.辽宁省畜牧业经济管理站,辽宁沈阳110032;2.辽宁省农村发展研究中心,辽宁沈阳110032)

自二十世纪五十年代英国人Polge和Smith发现了甘油对精子的保护作用,并使精液冷冻技术获得成功以来,在牛冷冻精液生产上已经得到广泛应用,并且取得了较高的受胎率。但是近些年来,牛精液冷冻技术进展缓慢,虽然在精液冷冻方法、稀释方法和稀释液配方等方面不断加以改进,使冷冻精液精子复苏率有所提高,但变化不大,主要原因是缺乏对精子复苏规律的研究[1]。

精液冷冻时,冰晶首先在细胞外的保护液中形成,大约在-10℃以上,细胞内的水仍不结冰,但变得愈益过冷。当继续降温时,加快细胞外水的冰晶形成,而在未结冰的水中,溶质的浓度越来越高。这就使细胞内过冷溶液和细胞外愈益变浓的溶质之间的化学势出现巨大差异[2],要消除这种差异主要取决于精液的降温速率。本试验从冷冻温度的选择,研究冷冻温度对精子复苏率的影响及精液降温速率变化规律,达到提高精子复苏率的目的。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用本站5头种公牛精液,法国卡苏公司生产的无动物源性稀释液,法国大欧公司生产的 0.25 mL细管。日本Olympus BX41型生物相差显微镜及显视系统,日本富士平工业株式会社生产的TSM-160MHS型电脑程控冷冻仪及FA113型低温平衡柜,北京宇时技术开发公司生产的MCT-200型自动数字测温仪,钻石牌血球分类计数器。

1.2 试验方法

试验采用优选法[3]确定精液冷冻温度点。每个冷冻温度点试验程序相同,根据精液在每个冷冻温度点冷冻后精子复苏率情况,找出精液适宜冷冻温度范围及降温速率,并根据测温数据绘制出精液适宜降温变化曲线。每次冷冻6支细管精液,将测温仪探头置于其中一支细管精液中固定,用于测定冷冻过程中细管内精液温度变化,另外5支细管精液每头牛各1支。精液冷冻前要摆放在冷冻架上,置于+4℃平衡柜中降温平衡。

表1 不同冷冻温度精子复苏率变化

1.3 试验程序

冷冻前,将冷冻仪温度调至所需要的冷冻点温度[4],测温仪自动记录间隔时间设置为10 s。冷冻时,取出平衡柜中准备好的精液样品同冷冻架一起迅速放入冷冻仪中,关闭冷冻仪上盖,同时打开测温仪报警和记录按钮,测温仪按照预先设定的时间间隔自动报警并记录每一时刻的温度,当精液温度降至试验所设置的温度时,向冷冻仪内喷入液氮,至精液温度降至-130℃以下时,取出样品精液投入-196℃液氮中待检。

1.4 精子活率评定方法

活率是指精液中直线前进运动精子数占精子总数的百分率。精子活率评定采用死活染色法[5],即取1滴精液,滴入盛有1～1.5 mL 1%刚果红染色液中,于37℃温度下浸染15 min,镜检前取1滴浸染后的精液和1滴5%苯胺兰染色液混合复染,涂片晾干后在400倍显微镜下观察,死精子着红色,活精子不着色,每个片子至少观察200个以上精子,根据死活精子数量计算精子活率。

2 结果与分析

2.1 不同冷冻温度对精子复苏率的影响

从表1可以看出,精液在-98℃冷冻精子复苏率最高,为73%。精液远离-98℃冷冻精子复苏率下降。精液在-86～-118℃范围冷冻精子复苏率较高,为65%。精液在-86～-118℃范围外冷冻,精子复苏率明显下降。

2.2 精液降温速率变化规律

从图1可以看出,精液冷冻过程降温速率不是匀速的,在 +4～-10℃范围,平均降温速率为7℃/min;在-10～-80 ℃范围,平均降温速率为35℃/min;在-80～-130℃范围,平均降温速率为 7℃/min。精液在-10～-80℃平均降温速率(35℃/min)与精液在-98℃降温速率(32.5℃/min)十分接近,说明精液发生相变阶段适宜的降温速率是提高精子复苏率的关键。

图1 精液适宜降温变化曲线

3 讨论

1)当精液在较低温度冷冻时,细胞内的水先形成冰晶,由于形成的冰晶对细胞产生机械损伤,从而造成精子死亡;当精液在较高温度冷冻时,细胞外的水先形成冰晶,由于形成冰晶产生溶液效应,导致细胞脱水、蛋白质变性,同样造成精子死亡;当精液在适宜温度冷冻时,液体结晶、细胞脱水之间接近于合适的关系,对细胞造成的损伤最小,有利于冷冻后精子复苏。因此,通过控制精液冷冻温度能有效提高精子复苏率。

2)影响精液降温速率的因素主要取决于冷冻温度和每次冷冻细管精液的数量。冷冻温度越高、冷冻细管精液数量越多,精液降温速率越慢;冷冻温度越低、冷冻细管精液数量越少,精液降温速率越快。使用自制冷冻槽或广口液氮罐冷冻细管精液,通过调整冷冻架与液氮面之间的距离来控制精液的冷冻温度,冷冻温度一般控制在-120～-140℃之间,冷冻时温度回升不得高于-90℃[6]。

3)细胞内冰晶的形成和细胞外溶液效应与精液的降温速率之间各为正负相[7],这就使精子活率与精液降温速率之间的相关曲线呈“V”字形。当精液以较快的速率降温时,细胞内形成冰晶的可能性是1,精子由于受到机械性损伤而死亡;当精液以较慢的速率降温时,细胞内形成冰晶的可能性是0,精子可能被溶液效应所致死。所谓最适宜降温速率是使细胞内形成冰晶的可能性和细胞外溶液效应都降低到最低程度。

4 结论

1)精液在不同的温度下冷冻,其精子复苏率是不同的。试验结果表明,精液在-98℃冷冻,精子复苏率最高;在-86～-118℃范围冷冻,精子复苏率较高;远离-86～-118℃范围冷冻,精子复苏率明显下降。

2)精液冷冻过程的降温速率是不同的。相变前,精液平均降温速率比较缓慢为7℃/min;相变过程精液降温迅速,平均降温速率为35℃/min;相变后,精液降温速率又开始缓慢,平均降温速率为10℃/min[8]。精液冷冻成败的关键是控制精液发生相变阶段的降温速率。

[1]沈家森,童孚中.公牛繁殖技术资料汇编[C].南京:农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心,2005,1.

[2]张坚中,徐铁铮.家畜冷冻精液[M].北京:中国农业科技出版社,1988.

[3]王元, 杨德庄.华罗庚的数学生涯[M].北京:北京科学出版社,2000.

[4]张儒学.有效控制精液冷冻初冻温度的方法[A].全国第七次动物繁殖学术讨论会论文摘要汇编[C].广州:中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会,1993.P27.

[5]杨学时,同广辅.全国牛冷冻精液国家标准培训班技术辅导教材[M].吉林:中国农业出版社,1985,7.

[6]陈伟生,等.牛冷冻精液生产质量管理手册[M].北京:中国农业出版社,2006,9.

[7]董伟.细胞低温生物学的基本问题[A].第九届国际家畜繁殖会议论文[C].1981,6,P.38-40.

[8]邓福金,等.牛细管精液冷冻温度曲线的研究[J].现代畜牧兽医,2006(12):10-12.