脑出血大鼠脑内NGF和BDNF蛋白表达变化的研究

石秋艳 何俊芳 孙惠芳 孙 鹏 刘 斌 张国志 王长友 燕 霞

1 华北煤炭医学院附属医院（063000）

2 唐山市铁路中心医院（063000）

3 河北工程大学附属医院（056002）

神经营养因子是一组由多细胞分泌的对神经组织起特殊营养作用的蛋白质和多肽分子。它们不仅能够促进发育中神经元的成熟与分化，而且还能够阻止损伤后神经元的死亡，促进其再生。目前关于脑出血后神经营养因子的表达及分布规律的文献报道较少，本实验旨在研究神经生长因子（nerve growth factor，NGF）和脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）在大鼠脑出血后变化规律及其特点，探讨神经营养因子在脑出血后的保护机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

健康的雄性SD大鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司）；NGF、BDNF多克隆抗体，二抗试剂盒及DAB显色剂（武汉博士德公司产品）；立体定位仪。

1.2 实验动物的分组

实验SD大鼠，体质量200～300g，随机分成正常组、假手术组和脑出血组，正常组6只，其余各组随机按时间动态分为术后3、6、12、24、72h、7d，每个时间点各6只。

1.3 模型的制作

参照Deinsberer等报道的方法[1]，大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉（0.035mL/kg），固定于立体定位仪上，于前囟前0.2mm中线向左侧旁3mm处钻一直径约为1mm的小孔，断尾取血，用微量注射器沿钻孔方向将50mL的不凝血缓慢注入左侧尾状核，留针10min，之后缓慢退针，缝合头皮。假手术组除不注射自体血外，余操作同实验组。实验过程中出现大鼠死亡及时补充。

1.4 模型成功的判断标准

表1 不同时间点各组大鼠脑内NGF阳性细胞数比较

表2 不同时间点各组大鼠脑内BDNF表达

脑出血组术后可见明显的肢体瘫痪，沿针道冠状切面切开脑组织可见血肿形成，正常组和假手术组肢体活动自如。

1.5 标本制取与组织学检查

各组大鼠在不同时间点给予水合氯醛腹腔麻醉（0.035mL/kg），开胸，将37℃ 0.9%氯化钠水溶液缓慢推入动物的体循环，持续3～5min（200mL）至右心房流出的液体基本无色，将灌流液换4%多聚甲醛磷酸缓冲液，取大脑组织固定于4%多聚甲醛24h，石蜡包埋组织学观察。

1.6 免疫组织化学染色法

严格按照说明书要求，①常规脱蜡至水。②3%H2O2室温20min灭活内源性酶。③高压修复抗原。④滴加封闭液20min。⑤加NGF、BDNF多克隆抗体4℃过夜。⑥滴加生物素化山羊抗兔二抗IgG 20min。⑦SABC 37℃反应30min，⑧DAB显色⑨苏木素复染，脱水，透明，封片，显微镜观察结果。

1.7 记数方法及阳性结果判定

随机选取大鼠脑内阳性细胞区域5个不同视野，记录阳性细胞数。

1.8 数据处理

应用SPSS16.0软件行单因素方差分析和t检验，P＜0.05为统计学检验标准。

2 结 果

2.1 NGF在脑出血大鼠脑内表达的变化规律

在正常组和假手术组中可见少量的NGF阳性细胞，主要位于大脑皮质及海马部位，并在各时间点无明显的变化。在脑出血组中，6h时NGF在血肿周围已经出现表达增强，于24h达高峰，在以后的时间点逐渐下降。从阳性细胞的形态来看，大部分为神经元细胞，胞体较大，形态较规则，免疫阳性颗粒位于胞体和突起，呈均匀的棕黄色颗粒。小部分是小胶质细胞，呈圆形或椭圆形，形态不规则，阳性颗粒位于细胞胞质。正常组阳性细胞数为（4.0±1.26），假手术组及脑出血组阳性细胞数，见表1。

2.2 BDNF在脑出血大鼠脑内表达的变化规律

免疫阳性颗粒主要位于神经元细胞核和和细胞质，以胞浆边缘显色较深，正常组和假手术组可在大脑皮质及海马部位发现BDNF少量表达。在脑出血组12h时，BDNF在血肿周围表达增加，阳性细胞密度增加（P＜0.05），于24h达高峰，7d仍有一定程度的高表达，与正常组和假手术组比较差异具有显著性（P＜0.05）。正常组阳性细胞数为（3.17±1.16），见表2。

3 讨 论

3.1 NGF变化特点分析

NGF广泛分布于中枢神经系统中，对神经系统有重要的神经营养和促神经突触生长的生物学效应。大量研究表明，NGF对ICH血肿周围损伤神经元具有保护和修复作用[2]。其神经保护可能机制为：①NGF 通过增加过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等自由基清除剂的活性，减轻脑出血后引起的神经元的损伤[3]。②抗细胞凋亡[4]。③维持细胞内Ca2+的稳态[5]。我们的实验动态观察了NGF在脑出血大鼠脑组织中表达的变化，在正常组和假手术中，发现少量的NGF阳性细胞，脑出血组6h，在血肿周围开始出现大量深棕色的阳性细胞，24h达高峰，48h已经开始下降，与正常组和假手术比较差异有显著性，说明在脑出血后，脑损伤后可诱导NGF一过性表达增高，从而发挥神经保护作用，但是时间短暂，含量低微。

3.2 BDNF变化特点分析

BDNF是成年大鼠脑内分布最广泛的神经营养因子，不仅调节神经元的生长、分化及轴突的功能，而且也是神经元维持生存和执行正常功能所必需的。在中枢神经系统损伤后，BDNF可为受损神经元提供营养而促进其存活与修复[6]。许多实验证实，BDNF通过激活其受体TrkB，阻断胞内损伤因子对蛋白激酶C的失活，以防止神经元发生变性、死亡[7]。我们的实验结果显示：12h时，BDNF在血肿周围表达增加（P＜0.05），于24h达高峰，与假手术组及正常组差异有统计学意义，其可能的机制为脑出血后脑损伤激发自我保护机制，诱导BDNF蛋白表达及分泌增加，保护受损神经元。传统的观念认为，BDNF是在靶器官合成，通过逆转运到神经元，发挥营养和维持存活作用的一种蛋白。Schutte等[8]研究发现，BDNF以出胞的形式分泌到细胞外基质，对临近的神经细胞发挥营养作用。我们的实验发现，在正常组和假手术组中，BDMF的阳性细胞主要分布于大脑皮质及海马部位，脑出血后，皮质及海马部位均表达增高，阳性细胞数数量增加，我们推测可能BDNF蛋白在皮质、海马及血肿周围的神经元或胶质细胞中合成，逆转运到达血肿周围，通过自分泌或旁分泌的方式发挥营养作用，这与以往的实验结论不同，但确切的机制尚不清楚。

另外实验发现，NGF和BDNF在空间分布上具有重叠性，时间变化上具有一定的相似性，是否两者在发挥神经保护作用中具有交叉或协同作用，有待于进一步研究。

综上所述，脑出血后脑损伤可激发内源性神经保护机制，引起NGF及BDNF蛋白表达增加，但其作用有限，时间短暂。

[1]Deinsberer W,Vogel J,Fuchs C,et al. Fibrinolysis and aspiration of experimental intracerebral hematoma reduces the volume of ischemic brain in rats[J]. Neurol res,1999,21(5):517-523.

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[4]Volosin M,Song W,A In eida RD,et al. Interaction of survival and death signaling in basal forebrain in neurons roles of neurotroph ins and proneuroph ins[J]. J Neurosci,2006,26(29):7756-7766.

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[7]周晖,毛萌.脑源性神经营养因子对缺氧胚鼠脑皮质神经元的保护作用[J].华西医大学报,2002,33(4):573-576.

[8]Schutte A,Yan Q,Mestres P,et al. The endogenous survival promotion of axotomized rat corticospinal neurons by brain-derived neurotrophic factor is mediated via paracrine,rather than autocrine mechanisms[J]. Neurosci Lett,2000,290(3):185-188.