t10,c12-CLA对猪皮下脂肪和背最长肌组织脂类代谢的影响

杜瑞平 高 民 卢德勋

共轭亚油酸（CLA）是亚油酸（LA）衍生的共轭双烯的多种位置与空间异构体的总称。理论上其主要位置异构有四种即 8，10-、9，11-、10，12-和 11，13-，而每种异构体又有四种几何异构体，因此共轭亚油酸的种类十分丰富，但无论是天然的还是人工合成的CLA，只有c-9，t-11和t-10，c-12是其最主要的生物活性异构体。近年来，共轭亚油酸(CLA)的生物学功能备受瞩目。作为一种新型功能性油脂，共轭亚油酸具有抗癌、抗动脉粥样硬化、抗糖尿病、降低胴体脂肪含量、调节免疫、促进生长、增加瘦肉率、改善肉品质及影响骨骼形成等诸多生理功能。c9，t11-CLA在提高动物机体的免疫力、抗癌和提高动物的生长性能方面作用较大,而t10,c12-CLA在改变动物机体的脂肪代谢方式以及降低脂肪在动物体内的沉积方面起主要作用[1]。

动物体脂的沉积是脂肪合成代谢与分解代谢的一种动态平衡，其沉积能力包括脂肪的合成、分解和转运三个方面。酶和激素在这些代谢过程中起到了至关重要的作用[1]。Lin 等（2001）发现，t10，c12-CLA显著降低了3T3-L1前脂肪细胞中LPL、FAS和AP2基因 mRNA 的水平[2]。Brandebourg 和 Hu（2005）也报道，CLA通过下调脂肪分化过程中关键基因的表达抑制猪皮下脂肪前体细胞的分化，进而抑制脂类沉积[3]。那么t10，c12-CLA对猪皮下脂肪和背最长肌两个部位前脂肪细胞增殖与分化及脂类代谢与沉积的影响是通过怎样的调节机制进行调控，本试验即在mRNA水平上研究t10，c12-CLA对脂类代谢关键酶中的脂肪酸合成酶（FAS）、苹果酸酶（ME）、激素敏感酯酶（HSL）、脂蛋白酯酶（LPL）及脂类代谢调控激素中的胰岛素和生长激素受体（INSR、GHR）的影响，旨在进一步探讨CLA对猪皮下脂肪和背最长肌组织脂类代谢的影响并初步揭示其机理。

1 材料与方法

1.1 试验动物

内蒙古农牧业科学院猪场30日龄猪。

1.2 试验试剂

t10，c12-CLA购买自Matreya公司；胰岛素、地塞米松、甲基异丁基黄嘌呤、青霉素和链霉素购买自Sigma公司；DMEM/F12干粉培养基、胎牛血清、牛血清白蛋白和胶原酶Ⅱ购买于Gibico公司；RNA提取、反转录和普通PCR反应所用试剂及定量PCR试剂盒（SYBR Green PCR Kit）购自上海生物工程技术有限公司；DNA Marker（DL1000）购自 TAKARA 公司，TG测定试剂盒购自北京五洲元业试剂公司，其余化学试剂购自南京建成生物试剂公司。

1.3 主要溶液配制

DMEM/F12培养液：10.0 g/l DMEM/F12培养基，三蒸水，10%胎牛血清，100 IU/ml青霉素，100 μg/ml链霉素，1.2 g/l NaHCO3，过滤（0.22 μm 滤膜）除菌，按每次实验需要量分装，4℃贮存备用。

组织消化液：Ⅱ型胶原酶配成1 mg/ml HBSS液，过滤除菌，-20℃储存备用。

100 μmol/l CLA 液:先用 100 μl无水乙醇溶解25 mg CLA，加入8.93 ml培养液配成0.01 mol/l的母液，滤菌，-20℃保存，使用时用培养液稀释即可。

分化储备液：分别称取胰岛素5.00 mg、地塞米松0.2 mg、甲基异丁基黄嘌呤55.63 mg溶于500 μl无水乙醇中，待完全溶解后加三蒸水至50 ml，滤菌，-20℃保存。

1.4 组织块培养[4]

（1）无菌切取仔猪肩胛部皮下脂肪约5 g、背最长肌约8 g，75%酒精中浸泡3～5 s，然后用D-Hanks液清洗3次，置于消毒的PBS液中；（2）在培养液或者平衡盐溶液中分离去除组织中可见的纤维及血管,反复剪切至1 mm3大小为止（呈糊状）。然后用吸管吸取HBSS液把附着在剪刀上的组织小块冲下，并补加3～5 ml HBSS液后，去上清，余下的组织块即可用于培养；(3)用眼科探针将组织小块均匀摆布于60 cm的培养皿，每小块间距约0.5 cm，置5%CO2、37℃培养箱1～2 h左右，再向底部轻轻注入5 ml完全培养液，于CO2培养箱(37℃,5%CO2)中静置培养，开始2 d尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养第3 d换液，此后每2 d换液一次。细胞汇合后用基础培养液漂洗后（一定不要剩余血清），然后改用无血清分化培养液培养至第10 d。

1.5 TG含量测定

试验处理第9 d收集各组细胞，超声波处理，按TG试剂盒说明书检测细胞内TG含量，结果以μmol/ml表示。

1.6 荧光定量PCR

1.6.1 引物设计与合成

登陆NCBI网站查询相关基因序列，使用DNAMAN软件设计PCR特异引物，委托上海生物工程公司合成。将冻干粉状态的引物离心后，用灭菌超纯水配制成 100 μmol/l贮备液和 20 μmol/l工作液，-20 ℃保存。

1.6.2 荧光定量PCR

定量PCR反应体系见表2。优化反应程序如下：（1）95 ℃预变性 15 min；（2）95 ℃变性 30 s；（3）53～60 ℃退火30 s；（4）72 ℃延伸30 s，循环40 次；（5）72 ℃延伸1 min；（6）70～95℃生成融解曲线。反应结束后，样品保存于-20℃备用。

1.7 试验设计

共设2个处理，处理1为阴性对照（添加0.1mmol/l BSA），处理 2 添加 100 μmol/l的 t10，c12-CLA，每个处理设6个平行，培养开始即加入BSA与t10，c12-CLA进行处理至第10 d。试验结束后收集细胞保存备用。

表1 引物设计参数

表2 荧光定量PCR反应体系

1.8 统计分析

采用SPSS 11.5软件中单因素方差分析进行统计。P＜0.05时确定为差异显著，P＜0.01时确定为差异极显著。

2 结果与讨论

2.1 t10,c12-CLA对猪皮下脂肪和背最长肌内脂类代谢关键酶的影响（见图1）

图1 脂肪代谢酶FAS、ME、LPL及HSL的相对基因表达水平

图1为荧光定量PCR测定脂肪代谢关键酶类FAS、ME、LPL及HSL的分析结果。脂质的积累是脂肪合成与分解代谢的动态平衡结果，在这一过程中，生脂酶和解脂酶发挥着重要作用，FAS与ME是脂肪酸生物合成甘油三酯反应的主要限速酶之一，LPL和HSL则是参与脂肪分解过程的关键酶类，它们是脂肪代谢和沉积的系列酶促反应的关键调节因素，它们的表达水平和活性高低预示着TG合成的变化。本试验结果表明，100 μmol/l t10,c12-CLA显著抑制了猪皮下脂肪FAS基因表达及背最长肌HSL和LPL基因表达，并显著提高了猪皮下脂肪HSL基因表达（P＜0.05），两个部位其它酶基因则无显著性差异（P＞0.05）。我们由此可以发现，t10,c12-CLA处理后，猪皮下脂肪的脂肪合成相关酶（FAS）基因表达显著下降的同时脂肪分解酶（HSL）基因表达显著提高，而背最长肌的脂肪分解酶 (HSL、LPL)基因表达则显著下降，这一变化规律预示t10,c12-CLA处理后，就酶的作用而言，猪皮下脂肪的脂肪合成代谢弱于分解代谢，而肌内脂肪的脂肪合成代谢则强于分解代谢。

2.2 t10,c12-CLA对皮下脂肪和背最长肌组织脂类代谢关键调控激素的影响

机体对代谢途径反应速度的调节控制能力称为物质代谢调节(Metabolic regulation)，生物的进化程度越高，代谢调节越复杂，越精细。物质代谢调节包括细胞水平、激素水平和整体水平三种调节方式[5]。上一小节关于酶基因表达即属于细胞水平调节，这一小节对激素水平进行了研究。与脂肪代谢有关的激素，包括很多种，生长激素和胰岛素是其中重要的两种，生长激素（GH）有促进脂肪分解、抑制脂肪合成的作用；而胰岛素(INS)则有促进生脂、抑制解脂的作用。GH和INS发挥生理作用的第一步是与靶细胞膜表面的受体(GHR，INSR)结合，由受体介导将信号传入胞内从而发挥其生物学功能[6-7]，所以说受体的表达和活性最终反映了相应激素的调节能力，因此本研究对两种激素受体GHR和INSR进行了mRNA水平的测定。图2为荧光定量PCR测定GHR和INSR的分析结果。结果表明，100 μmol/l t10,c12-CLA显著抑制了猪皮下脂肪INSR基因表达，并提高了猪背最长肌INSR基因表达水平（P＜0.05），而两个部位GHR基因表达的处理组与对照组无显著性差异（P＞0.05）。此结果也说明100 μmol/l t10,c12-CLA通过调节猪皮下脂肪和背最长肌组织内INSR水平进而影响两个部位的脂肪代谢。

图2 GHR和INSR的相对基因表达水平

2.3 t10,c12-CLA对猪皮下脂肪和背最长肌组织TG合成的影响（见图3）

图3 t10,c12-CLA对TG含量的影响

前体脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞后，伴随分化所发生的分子事件的最终结果都表现为细胞内TG含量的变化，为定量检测t10,c12-CLA对皮下脂肪和背最长肌组织脂肪沉积的影响，本试验采用TG试剂盒测定 TG含量。 结果表明（见图 3），100 μmol/l t10,c12-CLA显著降低了猪皮下脂肪内TG含量，而提高了猪背最长肌的的TG含量（P＜0.05）。充分说明t10,c12-CLA抑制了猪皮下脂肪沉积的同时提高了肌内脂肪含量。TG的变化规律也与前面脂肪代谢酶与激素所表明的两个部位脂肪合成与分解代谢规律相一致。

2.4 总体讨论

关于CLA对脂肪组织脂质代谢和沉积的影响，Evans等（2002）的研究结果表明，t10，c12-CLA 可减少细胞中甘油三酯含量[8]。Lin 等（2001）发现，t10，c12-CLA显著降低了3T3-L1前脂肪细胞中LPL、FAS和AP2基因mRNA的水平[2]。有关CLA抑制脂肪细胞分化，减少甘油三酯沉积的机理，在鼠上及3T3-L1前脂肪细胞系上的研究表明t10，c12-CLA对脂肪细胞分化以及甘油三酯沉积的抑制主要是由于该单体对前脂肪细胞增殖的抑制以及提高了细胞中脂类的分解[9-10]，而t10，c12-CLA对人脂肪细胞分化和甘油三酯沉积的抑制则主要是通过抑制前脂肪细胞分化过程来实现[11-12]。在猪脂肪体外培养试验中，有关CLA调控作用的报道也不一致[3，13-15]，但正效应报道表明，一方面，CLA可以通过抑制猪前脂肪细胞的增殖、分化以及脂类合成的关键酶基因的表达来减少脂肪的沉积；另一方面，CLA通过与脂肪酸氧化分解相关的酶，如脂酰辅酶A合成酶、脂酰辅酶A脱氢酶等结合，增强脂肪酸的氧化，从而减少甘油三酯合成。

结合前面的研究结果，我们可以这样认为：t10，c12-CLA显著抑制和促进猪皮下和背最长肌前脂肪细胞分化和脂类沉积中的关键基因如FAS、INSR、LPL、HSL等的基因表达，从而抑制和促进了前脂肪细胞的分化最终影响其甘油三酯沉积。

3 小结

本试验中，100 μmol/l t10,c12-CLA（10 d处理）显著抑制了猪皮下脂肪FAS、INSR与背最长肌HSL和LPL的基因表达并降低了皮下脂肪的TG含量，同时显著促进了猪皮下脂肪HSL和背最长肌INSR的基因表达并提高了猪背最长肌的TG含量（P＜0.05）；本研究结果从脂肪代谢关键酶类及调控激素角度揭示了t10,c12-CLA对猪皮下脂肪和背最长肌组织脂肪代谢和沉积的差异性调控机制，进一步证实了t10,c12-CLA抑制猪皮下脂肪沉积同时提高肌内脂肪含量。

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