HLA-DRB1基因多态性与新疆维吾尔族人群结核病易感性的相关性研究*

王 喜,贺 鹏,刘玉彩,吴 芳,王 萍,章 乐,张万江

结核病目前仍然是威胁人类三大感染性疾病之一,全球约1/3人口感染结核分枝杆菌。但是,在感染人群中仅1/10发病,提示个体差异可能与结核病易感性相关。现代免疫学证实,T细胞受体-抗原肽-主要组织相容性复合体构成的三分子复合体是特异性细胞免疫应答的分子基础。HLA-Ⅱ类基因在抗原提呈和免疫应答中起着重要作用,其某些变异的等位基因可能使人体对某些疾病产生易感性〔1〕。国外已有不少学者对此进行了研究并取得了令人振奋的成果。我国也有中国北方汉族部分人群肺结核发病与 HLA-DRB1*15等位基因密切相关〔2〕,中国南方汉族部分人群肺结核发病与DR16等位基因密切相关的报道〔3〕。但有关HLA-DRB1等位基因与中国新疆维吾尔族人群结核病易感性的相关性研究未见报道。由于HLA等位基因在不同种族、不同地域的人群中有很大的差异,因此对不同种族、不同地域的结核病患者与HLA基因的相关性进行研究其意义将更加重大。我们采用聚合酶链反应-序列特异性引物(polymerase chain reactionsequence specific primers,PCR-SSP)技术对226例新疆维吾尔族肺结核病患者和231例新疆维吾尔族健康对照者进行HLA-DRB1基因分型并比较其基因频率(GF),探讨HLA-DRB1基因多态性与新疆维吾尔族人群结核病易感性的关联。

1 材料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 肺结核病例组 新疆阿克苏地区长期生活的维吾尔族结核病患者226例,其中男115例、女111例,年龄18～68岁。病例按照国家制定的肺结核诊断标准〔4〕诊断。

1.1.2 健康对照组 新疆阿克苏地区长期生活的维吾尔族正常人231名,其中男118名、女113名,年龄20～70岁。

1.2 主要试剂及仪器 Tap DNA聚合酶(北京天根生物公司)、蛋白酶 K(德国Merck公司)、引物(北京三博远志生物公司)、dNTP(北京天根生物公司)。T-GRADIENT PCR仪(Bio-RAD,USA),微量凝胶电泳系统(Bio-RAD,USA),紫外光分析系统(Bio-RAD,USA)。

1.3 试验方法

1.3.1 外周血白细胞基因组DNA提取 取抗凝血加入2倍体积的淋巴细胞分离液,用水平离心机以1 500 r/min离心 30min收集白细胞,之后用PBS洗涤2遍。用酚氯仿法提取白细胞中的 DNA〔5〕。

1.3.2 DNA纯度测定 取DNA样本少许,用紫外分光光度计测定其在波长230、260、280nm处的吸光度值。若OD260/OD280＞1.7,OD260/OD230＞2.0,则DNA纯度合格,否则重新提取。

1.3.3 引物的设计与合成 序列特异性引物(SSP)共13对 ,参照Olerup 等〔6〕针对DRB1等位基因第二外显子多态性设计的特异性碱基序列。阳性内对照选取人生长激素基因,上游引物序列为:5'-GCCT TCCCAACCAT TCCCTTA-3',下游引物序列为:5'-TCACGGATT TCTGT TGTGT TTC-3',扩增片段长度为429bp。上述引物均由北京三博远志生物公司合成。所扩增的13个DRB1等位基因名称、扩增片段长度及其各引物序列见表1。

表1 HLA-DRB1基因PCR-SSP分型采用的各引物序列和产物大小Table 1 Primer sequences and sizes of PCR products used for HLA-DRB1 genotyping by PCR-SSP

1.3.4 特异性PCR扩增 每一个样本DRB1位点同时进行13个独立的PCR反应,每一个反应管中均含有确定相应位点等位基因型别的特异性引物和内对照引物。PCR反应体系:10×PCR buffer 3μL,2.5mmol/L dNT P 4μL,10pmol/μL 的特异性引物各0.8μL,10pmol/μL的内对照引物各0.3μL,50-100ng/μL 基因组 DNA 3μL,2.5U/μL Tap DNA 聚合酶0.8μL,用去离子水补足至25μL。扩增条件为:94℃预变性5min;94℃变性30s,60℃退火1min,72℃延伸 1min,共 30个循环;72℃延伸5min。

1.3.5 PCR扩增结果检测 取扩增产物5μL与上样缓冲液 1μL混匀,用 2%的琼脂糖凝胶电泳,100V,25min。电泳结束后于紫外成像仪上观察结果并记录。

1.3.6 DNA测序 对每一等位基因随机抽取10%PCR扩增产物送上海生工生物技术有限公司进行精确核酸序列检测。

1.3.7 统计学分析 两组各等位基因频率的计算采用公式GF=1-(1-f)1/2,f为人群中某等位基因阳性个体的百分率。病例组与对照组等位基因分布的差异采用 χ2检验或Fisher's精确检验。用校正P值(Pcorrect,Pc值)以Pc＜0.05作为有显著性差异的判断标准,Pc值等于P值乘以实验研究中所检测到的等位基因个数。疾病与H LA-DRB1等位基因的相关性通过计算比值比 OR(odds ratio)和95%可信区间(95%confidence intervals,95%CI)来表示;统计分析由SPSS13.0统计分析软件处理。

2 结 果

2.1 HLA-DRB1基因特异性扩增结果 每个样本DRB1位点同时进行13个独立的PCR反应,每次PCR反应的结果判断必须在有内对照引物扩增条带出现的前提下进行。个体的H LA-DRB1基因型别直接由相应特异性引物扩增条带的出现确定。图1为一例样本PCR-SSP扩增产物电泳图谱。

图1 HLA-DRB1*04/07杂合体PCR-SSP扩增产物电泳图谱Fig.1 Electrophoresis of the amplified PCR-SSP products of HLA-DRB1*04/07 heterozygote

2.2 测序结果 对每一等位基因随机抽取10%PCR扩增产物进行测序,测序结果利用NCBI中的BLAST软件分析后,与参考序列同源性高达99%。

2.3 病例组和对照组 HLA-DRB1基因频率检测结果 PCR-SSP法扩增HLA-DRB1各等位基因在226例PTB病例组及231例正常对照组中的分布情况,详见表2。在所检测的13对等位基因中我们发现:肺结核病例组中DRB1*11等位基因频率显著高于健康对照组,两组的GF值分别为4.53%和1.09%,差异有统计学意义(χ2=9.872,OR=4.388,Pc=0.026＜0.05)。肺结核病例组中HLADRB1*04基因频率显著高于健康对照组,两组的GF分别为12.77%和8.36%,但P值经过校正后Pc＞0.05,差异无统计学意义。

表2 肺结核病例组与对照组的HLA-DRB1等位基因频率比较Table 2 Comparision of the HLA-DRB1 alleles frequence of PTB patients and controls

3 讨 论

随着基因组流行病学的发展,宿主易感基因在结核病发生与发展中的作用日益受到人们的重视,越来越多的结核病候选易感基因被确认,通过关联分析研究这些基因在结核病发生发展中的作用已成为当前该领域一个重要的研究方向。

H LA复合体遗传区位于人类6号染色体短臂上,全长约4 000 kb含有约 4×106个碱基,约占人类基因组碱基数的0.1%。H LA复合体是迄今己知人体最复杂的遗传多态性和免疫多态性基因体系〔7〕现已发现有70余种疾病与 HLA基因多态性相关联,其中大多数自身免疫性疾病与HLA-II类基因相关。国内外许多学者研究发现结核病易感基因HLA-DRB1基因的多态性与结核病发生发展有关联,而且对于不同的人种和民族,研究结果不完全相同,有的结果还完全相反,因此推测结核病易感基因HLA-DRB1基因的多态性与结核病易感性有关联,而且可能存在明显的种族差异性。

有关H LA-DRB1基因与肺结核病的关联国内外都有相关报道:伊朗人肺结核病与DRB1*07密切相关〔8〕,DRB1*0803与朝鲜人肺结核耐药患者密切相关〔9〕,HLA-DRB1*13,*14等位基因与图瓦地区肺结核病密切相关〔10〕,南非Venda地区肺结核病与DRB1*1302密切相关,同时发现单倍型DRB1*1101-1121存在连锁不平衡〔11〕,波兰北部人群结核病与 DRB1*14、DRB1*16 相关〔12〕,墨西哥东北部肺结核病人与H LA-DR11(5),-DR16(2)紧密相关,DR11(5)-DQ7(3),DR14(6)-DQS(1),DR16(2)-DQ7(3)单倍型在病例组中频率较高;HLA-DR17(3),DQ8(3)等位基因及DR17(3)-DQ2,DR4-DQ8(3)单倍型在对照组中频率较高〔13〕。

我们的研究结果显示:新疆维吾尔族人群肺结核病例组中HLA-DRB1*11,等位基因频率显著高于健康对照组,提示新疆维吾尔族人群肺结核的发病可能与H LA-DRB1*11等位基因相关联。这与我国先后报道北方汉族部分人群肺结核病易患性与DRB1*15密切相关,南方汉族部分人群肺结核病的易感基因可能为DR16不相一致。这进一步证实了不同地域、不同种族的人群对结核分枝杆菌的易感性不同。

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