响应面法优化荸荠皮总黄酮的提取工艺

高 山，胡 平，龙世平

(1.湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000；2.恩施职业技术学院生物工程系，湖北 恩施 445000)

荸荠(Eleocharistuberose)，别名马蹄、地栗等，是莎草科多年生浅水草本植物[1]，分布广泛[2]。除直接食用外，还被加工成淀粉、果脯、罐头和饮料等产品[3]。研究表明，荸荠皮中含有一种不耐热的抑菌物质——荸荠英，荸荠英中含有游离黄酮类化合物、生物碱、有机酸、皂苷及酚类等成分[4～6]，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、绿脓杆菌等均有不同程度的抑制作用，可作为一种天然食品防腐剂用于食品加工[7]。黄酮类化合物具有降血脂、降血糖、增强人体免疫力的功能，并对糖尿病、高血压、冠心病等疾病有辅助疗效[8]，因此，研究荸荠皮中黄酮类化合物的提取工艺对提高荸荠的附加值意义重大。

黄酮类化合物常用的提取工艺主要有水提法[9]、微波法[10]、超滤法[11]等，对于提取工艺的优化多采用正交实验法[12]，而采用响应面法优化工艺的较少。作者在此采用响应面分析法[13]对荸荠皮总黄酮的提取工艺进行了研究，拟为荸荠皮的综合利用提供一条新的途径。

1 实验

1.1 材料与试剂

荸荠皮：收集于恩施市土桥坝各鲜荸荠市场，剔除杂质及腐迹，于干燥箱中80℃烘6 h，再用粉碎机粉碎，过筛，保存，备用。

芦丁标准品，95%乙醇，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠等。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的绘制

准确称取干燥后的芦丁标准品20 mg，用30%(体积分数，下同)的乙醇溶解，并全部转入100 mL容量瓶中，用30%乙醇定容，摇匀，得浓度为0.2 mg·mL-1的芦丁标准溶液。分别取上述芦丁标准溶液0.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL、12.0 mL于7支25 mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，静置6 min；加入10%硝酸铝溶液1 mL，混匀，静置6 min；加入4%氢氧化钠溶液10.0 mL，混匀，用30%乙醇定容；15 min后于510 nm处测定吸光度A，以试剂空白作为参比。

1.2.2 提取方法

准确称取干燥荸荠皮粉末1 g，加入30%乙醇25 mL，在水浴提取温度60℃下提取90 min，迅速冷却，于8000 r·min-1离心8 min，得提取液。

1.2.3 黄酮类化合物含量的测定

准确吸取提取液2.5 mL于25 mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，静置6 min；加入10%硝酸铝溶液1 mL，混匀，静置6 min；加入4%氢氧化钠溶液10.0 mL，混匀，用30%乙醇定容；15 min后于510 nm处测定吸光度，将吸光度代入标准曲线，求出提取液黄酮类化合物浓度，按下式计算黄酮类化合物含量：

式中：Q为黄酮类化合物含量，mg·g-1；c为测定液黄酮类化合物浓度，mg·mL-1；V1为测量时定容的体积，mL；V2为提取液体积，mL；V3为测量时提取液体积，mL；m为提取时荸荠皮质量，g。

1.2.4 荸荠皮总黄酮提取条件的优化

1.2.4.1 单因素实验

分别改变乙醇体积分数、固液比、提取温度、提取时间进行单因素实验，测定提取液的吸光度，计算荸荠皮粉末中总黄酮的提取量(Y)。单因素实验设计编码水平见表1。

表1 单因素实验设计编码水平

1.2.4.2 响应面法优化

根据单因素实验结果，对主要因素采用Box-Benhnken设计实验，并运用SAS软件对实验数据进行响应面分析，以获取最佳工艺参数[14]。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

测定芦丁标准溶液在不同浓度时所对应的吸光度，以浓度为横纵标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，结果见图1。

图1 芦丁标准曲线

芦丁标准溶液浓度c(mg·mL-1)与 吸光度A的回归方程为A=0.1765c+0.003，相关系数R2=0.9993，表明吸光度与芦丁标准溶液浓度呈显著线性相关。

2.2 单因素实验结果

按照1.2.4.1方法对荸荠皮粉末进行提取，得到各提取条件下的总黄酮提取量见图2。

图2 单因素对总黄酮提取量的影响

由图2可以看出，随着乙醇体积分数的增大，黄酮类化合物提取量不断增加，由于50%相比于40%的提取量增加不大，考虑到成本，选择乙醇体积分数40%为中心点做响应面实验；固液比为1∶10时，黄酮类化合物提取量较低，说明受黄酮类化合物溶解度的影响，太小的固液比造成荸荠皮中的黄酮类化合物溶解不完全，而固液比1∶15与1∶30的变化不大，考虑到在提取过程中提取液要挥发，固液比太小时操作不便，故选择固液比1∶20为中心点做响应面实验；随着温度的升高，黄酮类化合物的提取量逐渐增加，当温度升高到70℃时，黄酮类化合物提取量最高，故选择提取温度60℃为中心点做响应面实验；黄酮类化合物的提取量在提取时间为90 min时达到最高，然后随提取时间的延长趋于稳定，综合考虑，选择提取时间为90 min，不采用响应面实验优化。

2.3 响应面实验优化工艺参数

单因素实验结果表明，乙醇体积分数、提取温度、固液比对荸荠皮中总黄酮的提取量有显著影响。因此，固定提取时间为90 min，通过响应面分析对乙醇体积分数、提取温度、固液比3个因素进行更深入的研究。

2.3.1 Box-Benhnken中心组合设计优化荸荠皮总黄酮提取工艺

根据Box-Benhnken 中心组合实验的设计原理，采用3因素3水平响应面分析方案进行实验并采用响应面法分析实验数据。中心组合实验的因素与水平设计见表2，响应面实验设计及结果见表3，方差分析见表4。

表2 中心组合设计实验的因素水平

表3 响应面实验设计及结果

图3 荸荠皮总黄酮提取量影响因素的响应面分析

表4 方差分析

由表4可以看出，乙醇体积分数的影响最大，达到极其显著水平(P<0.001)，提取温度、固液比、各平方项、乙醇体积分数与提取温度的交互项也对荸荠皮总黄酮提取量影响显著(P<0.05)。

2.3.2 二次响应面回归模型的建立

响应面软件分析结果经回归拟合后，得如下回归方程：

s=0.2991，R-sq=97.7%，R-sq(adj)=93.7%。表明模型的拟合性很好。

响应面分析各因素之间的交互作用结果见图3。

由图3可知，乙醇体积分数对荸荠皮总黄酮提取量的影响最为显著，表现为曲线较陡；而固液比与提取温度次之，相应表现为曲线较为平滑，且随其数值的增加或减少，响应值变化较小。

对Xi求偏导并令其为零的三元一次方程组为：

解三元一次方程组得：X1=-0.61、X2=0.32、X3=0.34,即最佳工艺条件为：提取时间90 min、乙醇体积分数33.9%、提取温度56.8℃、固液比1∶21.7(g∶mL)。预测荸荠皮总黄酮提取量为12.65 mg·mL-1。

2.4 验证实验

准确称取荸荠皮2 g，在乙醇体积分数为33.9%、提取温度为56.8℃、固液比为1∶21.7(g∶mL)的最佳条件下进行提取，3次实验得到的总黄酮提取量分别为12.51 mg·mL-1、12.48 mg·mL-1、12.50 mg·mL-1，平均提取量为12.50 mg·mL-1。实验值与模型预测值基本一致，可见该模型能较好地预测荸荠皮总黄酮的提取情况。

3 结论

通过对预测模型的验证实验，荸荠皮总黄酮提取量达12.50 mg·mL-1，与模型预测值基本一致，说明模型能较好地反映实际情况，利用响应面分析法得到的荸荠皮总黄酮的提取工艺参数真实可靠，具有实用价值。

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