赭曲霉对16α,17α-环氧黄体酮的C11α-羟基化工艺研究

16α,17α-环氧黄体酮(16α,17α-Epoxyprogesterone，EP)全称为16α,17α-环氧孕甾-4-烯-3,20-二酮，又名沃式氧化物，白色结晶粉末，无臭，微溶于乙醇、甲醇、甲苯。利用微生物进行C11α-羟基化是甾体生物转化中的一个重要反应[1]，得到的C11α-羟基化产物是合成地塞米松、强的松龙等药物的重要中间体。据文献报道，应用于16α,17α-环氧黄体酮C11α-羟基化的微生物生产菌种主要有黑根霉(Rhizopusnigricans)[2～4]、雅致小克银汉霉(Cunninghamellaelegans)[5]和绿僵菌(Metarhiziumsp.)[6]等，产率一般在45%～75%之间，对发酵条件及操作要求较高且副产物种类较多。

作者就赭曲霉(Aspergillusochraceus)405转化16α,17α-环氧黄体酮的C11α-羟基化工艺进行了研究，并将羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)应用于该反应中，提高了转化率。

1 实验

1.1 试剂和仪器

16α,17α-环氧黄体酮，天津津津药业有限公司；其它试剂均为市售分析纯。

Agilent1100型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；HP-β-CD(取代度6.52)，西安德立生物化工有限公司。

1.2 菌种和培养基

菌种：赭曲霉(Aspergillusochraceus)405，天津科技大学微生物制药研究室保藏。

斜面培养基(g·L-1)：土豆200，葡萄糖20，琼脂20，酵母膏1，pH值自然。

转化培养基(g·L-1)：葡萄糖30，玉米浆40，蚕蛹粉2，硫酸铵1.5，pH值6.4。

1.3 16α,17α-环氧黄体酮的C11α-羟基化反应

将斜面菌种于28℃ 培养7 d，无菌水洗下孢子，制成浓度为5×107个·mL-1的孢子溶液，取一定量接种于50 mL/250 mL三角瓶发酵培养基中，28℃、200 r·min-1振荡培养28 h，加入10 g·L-1EP，继续转化48 h。

1.4 HP-β-CD的添加方式

称取与EP不同摩尔比的HP-β-CD，用紫外线灭菌30 min后分别加入到发酵液中。

1.5 相溶解度的测定

配制一系列浓度的 HP-β-CD 溶液，各取10 mL于具塞试管，加过量的EP，在摇床上28℃、200 r·min-1恒温振荡24 h。取上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤，用高效液相色谱法测定其浓度，以EP浓度为纵坐标、HP-β-CD浓度为横坐标，绘制相溶解度图。

1.6 转化率测定

取2 mL发酵液加入4 mL乙酸乙酯进行萃取，离心，精确取上清液0.1 mL于1.5 mL的小离心管中，自然风干后加1 mL流动相，12 000 r·min-1离心10 min。然后用高效液相色谱仪检测，色谱柱为Phenomenex C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流动相为甲醇∶水=80∶20(体积比)；流速1 mL·min-1；检测波长240 nm；柱温30℃；进样量20 μL；外标法检测。转化率依下式计算：

式中：X为液相测得的产物浓度，mg·L-1；d为稀释倍数；V为发酵液的体积,L；mEP为V体积内底物的质量,mg；MEP与M产物分别为底物与产物的摩尔质量，g·mol-1。

2 结果与讨论

2.1 摇床转速对转化率的影响

摇床转速对转化体系的影响主要包括溶氧和剪切力两方面，提高转速可以强化底物和氧气在菌体发酵体系中的传质，促进酶与底物的充分接触。但随着摇床转速的提高，剪切力也相应增大，会将菌丝打碎，反而不利于细胞的生长。考察摇床转速对转化率的影响,结果见图1。

图1 摇床转速对转化率的影响

由图1可知，当转速为200 r·min-1时，赭曲霉菌球大小一致，转化率最高，最适宜转化反应的进行。

2.2 接种量对C11α-羟基化反应的影响

配制浓度为5×107个·mL-1的赭曲霉孢子悬浮液，以不同接种量接种，考察接种量对C11α-羟基化反应的影响，结果见表1。

由表1可知，接种量较小，菌球大而数量少；随接种量增大，摇瓶内菌球变小、数量增加，发酵液逐渐呈粥状。转化率也随着接种量和摇瓶中菌球形态的不同而不同，接种量为2.0%时转化率最高达72.6%，此时，摇瓶中菌球呈小米状。

表1 接种量对EP C11α-羟基化反应的影响

2.3 底物投料方式对转化率的影响

考察了不同底物投料方式对转化率的影响，结果见图2。(1)有机溶剂助溶法：分别用甲醇、乙醇、丙酮、丙二醇、DMF、DMSO溶解EP，所有溶剂均按照4%的比例添加，然后超声振荡处理5 min以加速EP在溶剂中的分散，加入到已培养好的菌体中进行转化实验。(2)吐温80乳化法：用吐温80溶液高温乳化EP后，超声振荡5 min，然后加入到已培养好的菌体中进行转化实验。(3)干粉投料法：将EP紫外灭菌后直接加入到已培养好的菌体中进行转化实验。

图2 底物投料方式对转化率的影响

由图2可知，用乙醇溶解EP后进行超声振荡处理的投料方式的转化率最高，为74.2%。

2.4 转化培养基初始pH值对转化率的影响

赭曲霉转化EP，是利用胞内酶的作用，而酶与底物的作用必须有合适的pH值。另外，培养基初始pH值影响跨膜pH值梯度，影响膜的通透性，进而影响菌体生长与产物的生成，是生物转化的关键因素之一[4]。考察初始pH值对转化率的影响，结果如图3所示。

图3 转化培养基初始pH值对转化率的影响

由图3可知，转化培养基初始pH值为5.0时，转化率最高。

2.5 底物投加时间对转化率的影响

羟化酶为诱导酶，底物的添加时间往往对转化效果产生显著影响。选取在快速生长期内的不同时期加入EP进行转化实验，考察底物投加时间对转化率的影响，结果见图4。

图4 底物投加时间对转化率的影响

由图4可知，在28 h左右进行投料的转化率最高，达80.3%。

2.6 底物浓度对转化率的影响(图5)

图5 底物浓度对转化率的影响

由图5可知，转化率随底物浓度的增加而显著降低，底物浓度较低时(10 g·L-1)的转化率最高，达80.5%。

2.7 环糊精添加比例对转化率的影响

环糊精能显著增加EP等疏水化合物的水溶性，在一定范围内其溶解度的增加与环糊精的添加量呈线性关系(图6)。在转化过程进行4 h时添加与EP不同摩尔比的HP-β-CD，28℃、200 r·min-1反应48 h,结果见图7。

图6 EP在HP-β-CD溶液中的相溶解图

图7 HP-β-CD与EP摩尔比对转化率的影响

由图7可知，加入与EP摩尔比为(0.25～1.25)∶1的HP-β-CD时，底物转化率随着HP-β-CD加量的增大而上升；n(HP-β-CD)∶n(EP)为1.25∶1时，转化率最高，为93.1%，较未添加HP-β-CD的转化率提高了12.6%;继续增加HP-β-CD的量，转化率转而下降。

3 结论

确定了利用赭曲霉进行16α,17α-环氧黄体酮的C11α-羟基化的最佳转化条件如下：转化培养基初始pH值为5.0、接种量为2.0%、摇床转速为200 r·min-1、培养28 h时投加用乙醇溶解的EP、EP浓度为10 g·L-1，此条件下转化率达80.5%。在转化反应进行4 h时添加与EP摩尔比为1.25∶1的HP-β-CD，转化率达到93.1%，较未添加HP-β-CD的转化率提高了12.6%。

参考文献：

[1] Fernandes P，Cruz A，Angelova B，et al．Microbial conversion of steroid compounds：Recent developments[J]．Enzyme and Microbial Technology，2003，32(6)：688-705．

[2] 杜大庆，刘玲玲，张星元，等．黑根霉对甾体的C11α-羟基化反应[J]．河南工业大学学报(自然科学版)，2006，27(3):70-74.

[3] 万金营，杜连祥，巩培，等．双液相体系下对黑根霉C11α-羟基化16α,17α-环氧孕酮的研究[J]．天津科技大学学报，2009，24(2):13-16．

[4] Roglic U， Znidarsic-Plazl P，Plazl I．The influence ofβ-cyclodextrin on the kinetics of progesterone transformation byRhizopusnigricans[J]．Biocatalysis and Biotransformation，2005，23(5)：299-305．

[5] 徐银，陈小龙，郑裕国．雅致小克银汉霉对16α,17α-环氧黄体酮C11α-羟基化的工艺研究[J]．中国生化药物杂志，2009，30(4):239-242．

[6] 李安华，王艺军，王明道，等．绿僵菌羟基化16α,17α-环氧黄体酮的工艺研究[J]．河南科学，2007，25(5)：754-757．