高效液相色谱法测定甜瓜蒂中葫芦素B含量

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(陕西天远药业有限公司，陕西 西安 710072)

甜瓜蒂为葫芦科一年生草质藤本植物甜瓜(CucumismeloL.)的果蒂，别名瓜蒂、苦丁香，始著录于《神农本草经》，为上品之药，系《中国药典》一部1977年版收载品种，味苦，性寒，入胃经，可用于治疗痰涎宿食、壅塞上脘、胸中痞鞭、风痰癫痫、湿热黄疸、四肢浮肿、鼻塞、喉痹等。实践证明甜瓜蒂治疗顽固性黄疸疗效显著[1]。成分研究表明，甜瓜蒂主要含葫芦素系化合物，包括葫芦素B、葫芦素E、葫芦素D、异葫芦素B、葫芦素B葡萄糖苷等，还含有甾醇、皂苷及氨基酸[2]。葫芦素系化合物中，葫芦素B(Cucurbitacin B) 占80%以上，是抗肝炎、肝癌的有效单体，主要用于因湿热毒盛所致迁延性肝炎、慢性肝炎及原发性肝癌的辅助治疗[3]。虽然高效液相色谱(HPLC)已成为中药原料和制剂质量控制的重要手段，但运用HPLC测定葫芦素B的报道很少[4～6]，且尚未见用于甜瓜蒂中葫芦素B的测定报道。作者采用高效液相色谱法测定葫芦素B含量，方法简便、快速、可靠、实用，可作为甜瓜蒂药材的质量控制方法。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

甜瓜蒂药材购自西安药材批发市场。

葫芦素B对照品(TLC检查为单一斑点，归一化法计算纯度为99.13%)，百灵威化学技术有限公司；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其它试剂为分析纯。

L2000型高效液相色谱仪，紫外可见光检测器；UV-1200型紫外可见分光光度计。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.05 mol·L-1K2HPO4(40∶60)；检测波长：228 nm。在此条件下葫芦素B峰与其它杂质峰R>1.5，理论板数按葫芦素B峰计达3000以上。

1.2.2 对照品溶液的配制

精密称取葫芦素B对照品适量，置棕色瓶中，加乙腈制成100 μg·mL-1的溶液。

1.2.3 供试液的配制

取甜瓜蒂，粉碎，过100目筛，精密称取适量置100 mL容量瓶中，加甲醇100 mL，浸泡过夜，超声处理60 min，放冷，加甲醇定量，微孔滤膜过滤，取续滤液进样测定。

1.2.4 标准曲线的绘制

称取葫芦素B对照品约25 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1 mL、2 mL、5 mL、7.5 mL和10 mL，置10 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。分别取20 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，以峰面积A对浓度c(μg·mL-1)绘制标准曲线，拟合线性回归方程A= 4610.4c-1023，R=0.9994(n=5)，线性范围25.2～252 μg·mL-1。

2 结果与讨论

2.1 高效液相色谱图(图1)

图1 葫芦素B对照品(a)和甜瓜蒂药材(b)的HPLC图谱

2.2 稳定性实验

取甜瓜蒂药材，按1.2.3方法配制溶液，放置0 h、1 h、2 h、6 h、12 h分别进样，各测定5次，结果葫芦素B含量测定的RSD为1.34%。

2.3 重复性实验

取甜瓜蒂药材，按1.2.3方法配制溶液，测定其葫芦素B含量，测定5次，其葫芦素B平均含量为0.821%，RSD=1.68%。

2.4 回收率实验

精密称取已测定含量的样品适量，加入定量的葫芦素B对照品，按1.2.2和1.2.3方法配制溶液，测定葫芦素B的含量，计算回收率，结果见表1。

表1 葫芦素B的回收率

由表1可知，平均回收率为98.82%，RSD=1.75%。

2.5 样品测定

取不同产地的甜瓜蒂，按上述方法操作，测定葫芦素B的含量，结果见表2。

表2 不同产地甜瓜蒂药材的葫芦素B含量

由表2可知，6个不同产地药材的葫芦素B含量差别较大，总体来说，北方药材的葫芦素B含量高于南方药材，可能与各地土壤、气候、采收时间有关。

2.6 讨论

(1)葫芦素B分子结构中仅含α,β-不饱和酮的共轭结构(图2)，β-位含一烷基取代基，其最大紫外吸收波长预计为(215+12)nm。紫外扫描测定结果显示，其最大吸收波长为228 nm，符合经验计算结果，也与文献报道完全一致[4～6]。故检测波长采用228 nm。

图2 葫芦素B的分子结构

(2)采用甲醇系统分析，发现测定重复性较差，这可能是由于甲醇在230 nm的吸光度约为0.15，本底吸收大，不同程度地影响到测定结果。改用乙腈-0.1 mol·L-1K2HPO4为流动相后，测定重复性大幅提高，符合定量要求。

3 结论

建立了高效液相色谱法测定甜瓜蒂药材中葫芦素B含量的方法。采用Hypersil C18色谱柱，以乙腈-0.05 mol·L-1K2HPO4(40∶60) 为流动相，波长228 nm下检测。葫芦素B浓度在25.2～252 μg·mL-1范围内线性关系良好，平均回收率为98.82%。不同产地药材的葫芦素B含量相差很大。该法简便快速、重现性好，可用于甜瓜蒂药材中葫芦素B含量的测定。

参考文献：

[1] 贾建伟，杨积明，袁桂玉，等.甜瓜蒂经鼻粘膜给药治疗顽固性黄疸[J].天津医药，2004，32(6)：345-346.

[2] 江苏新医学院.中药大词典[M].上海：上海科学技术出版社，2004：756.

[3] WS3-B-3711-98，中华人民共和国卫生部药品标准[S].

[4] 黄哲娃，张莉，李海生.RP-HPLC法测定葫芦素滴丸中葫芦素B的含量[J].中草药，2003，34(5)：421-422.

[5] 黄璐琦，姚三桃.高效液相色谱法测定湖北栝楼根中葫芦素B的含量[J].中国中药杂志，1994，19(8)：490-491.

[6] 黄璐琦，姚三桃.高效液相色谱法测定异叶马交儿根中葫芦素B的含量[J].中草药，1994，25(10)：555-557.