蒙古羊Hoxd11基因CpG位点分布特征分析

赵 静 ，张立岭 ，2，巴 图

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特 010018；2.海南大学动物科学系，海口 570228；3.内蒙古农牧科学院畜牧研究所）

在哺乳动物胚胎早期，从受精到8细胞时期，真核基因组DNA是去甲基化的。从8细胞时期到桑椹胚，基因组DNA开始进行甲基化。在囊胚时期，完成甲基化。这个过程称为表观遗传修饰。DNA甲基化是DNA在复制后由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase,Dnmt）催化，将甲基转移到胞嘧啶第5位的碳原子上而形成5-甲基胞嘧啶（5mC）［1］。胞嘧啶容易发生甲基化，单个的甲基化胞嘧啶具有高度的自发性突变的趋势。胞嘧啶第5位碳原子的甲基化，不改变DNA分子的双螺旋构型[2]，也没有改变这种规律或者产生新的排列限制。DNA的双螺旋结构在转录时，由于解旋和解链，而不再存在大沟小沟的三级结构。许多实验证明，如果没有经历正常的DNA甲基化过程，动物胚胎不能正常发育。基因剔除、转基因以及体细胞克隆生成的胚胎常常会在囊胚时期死亡，或者出生后发育异常，包括巨大胎儿、生长过快及早死等现象［1］。

哺乳动物的Homeobox基因的1～3表达位置在头部枕骨区，4～6在颈椎区（包括第一胸椎），7～9在胸腰区，10～11在腰荐区，12～13在荐尾区。基因Knockout实验证明，鼠的Hoxc-8突变可使胸椎增加一个，随之肋骨也多生一对［3］。Hoxd11突变则导致鼠的腰椎或荐椎增加一枚［4］。

世界各地的大多数绵羊品种，除了颈椎都是7枚以外，胸、腰椎数目以13+6组合为主，13+7和14+6组合型少见，14+7组合极少见。但是，蒙古羊与其它品种绵羊不同，胸、腰椎的数目多见13+7和14+6组合型，14+7组合型也达到5%左右。这种胸腰椎数的变异，以非孟德尔方式遗传。公羊的胸腰椎数对后代的影响最明显，而母羊的多胸腰椎性状对后代没有影响。最近的研究表明，不同品种绵羊胸椎和腰椎数目的变异，与动物的主轴骨发育的调控基因homeobox C8和homeobox D11第一外显子序列的胞嘧啶甲基化的数量和位置有关，这两个基因是否表达，取决于基因来自父系，还是来自母系。其遗传规律和表达方式具有明显的表观遗传特征[5]。

关于胞嘧啶甲基化对基因功能的影响，过去有人认为，由于胞嘧啶第5位碳原子的甲基化，导致在甲基周围形成局部的疏水区，这一区域扩伸到B-DNA的大沟中，使B-DNA→Z-DNA。即胞嘧啶的甲基化改变了DNA分子的构型，使基因的转录停止［2］。但是，这个推测是不成立的。因为胸腺嘧啶第5位碳原子同样有一个甲基，单链DNA上的4种碱基排列是多种多样的，并无限制。

胞嘧啶的甲基化，无论从DNA的二维还是三维空间来看，都没有改变这种规律或者产生新的排列限制。而且DNA的双螺旋结构在转录时，由于解旋和解链，而不再存在大沟小沟的三级结构，所以，胞嘧啶甲基化在结构上没有改变DNA双螺旋的构型。基因序列中的胞嘧啶甲基化的生物学功能，无疑存在其他的机制。

研究证明蒙古羊14枚胸椎与Hoxc8基因的第一外显子甲基化有关，通过对该基因甲基化的定量检测，可以早期鉴别多胸椎个体［5］。蒙古羊Hoxc8 exon-1的碱基序列中，没有可能导致Z-DNA构象的CpGpCpGp［3］或ACACACAC序列，不存在具有免疫性或特异性很强的Z-DNA抗体。鉴于Hoxc8 exon-1的甲基化确实与蒙古羊多胸椎性状有关，本研究利用同样的思路和技术，分析Hoxd11 exon-1的CpG位点的分布特征，探索以蒙古羊Hoxd11 CpG特征为分子标记，早期识别和选择多腰椎个体。在此基础上，进一步分析Hoxd11 exon-1甲基化特征，为进一步阐释蒙古羊多胸椎性状的分子遗传机制，并且应用于多脊椎个体育种提供高新技术支持。

1 材料和方法

2007—2010年分3批，每批采集200只纯种成年蒙古羊血样，柠檬酸抗凝，液氮冻存。羊群来采自内蒙古锡林郭勒盟的东乌珠穆沁旗。用Wizard Genomic DNA Purification Kit（Promega，A1120） 提取蒙古羊基因组DNA。参考NCBI的GenBank相近物种的相应基因序列设计PCR引物，扩增目标序列。测序后，与已知物种序列比对，确认目标基因及其外显子和内含子，CpG的数量、位置、比例等。

由于在PCR实验条件摸索和弩表序列的引物筛选过程中，发现蒙古羊Hoxd11序列exon-1中CpG数量多，密度高，导致目标序列的PCR困难，因此，本实验专门设计了针对高CpG序列的PCR引物以及专门的PCR扩增条件。

Hoxd11全长扩增引物：上游引物：5'-CTCTTGTGCAATCGATGGCTCAGGT-3'；下游引物：5'-CAAAAACAAGTGCCTTCCAGCCC-3'。该引物的扩增产物长度2 197bp，覆盖整个目标基因。

2 结果

目标序列PCR扩增及测序结果表明，蒙古羊Hoxd11基因全长 1 772 bp，其中 exon-1 为 778 bp（见图 1），exon-2为236 bp，内含子为758 bp。该基因的全序列已提交 NCBI GenBank，编号（Accession No）为 GU059862。

图1 Hoxd11全长PCR扩增产物

Hoxd11 exon-1序列的CpG数：共有120个CpG；A，G，C，T的比例分别为12.72%、38.82%、37.92%、10.54%。Hoxd11 exon-2序列的CpG数：共有12个CpG。

由于Hoxd11 exon-1的CpG主要位于exon-1，而exon-2中的CpG极少，而且分布分散，所以，本文重点讨论Hoxd11 exon-1的CpG位点的分布。

在Hoxd11 exon-1的120个CpG中，位于遗传密码第1～2位的CpG共8个，编码一种氨基酸（精氨酸，R）。位于密码的第2～3位的CpG共47个，占所有CpG的39.17%（47/120），分别编码丝氨酸（S）5个，脯氨酸（P）18个，苏氨酸（T）2个，丙氨酸（A）22个。由于其余的65个CpG中的碱基C与G分别位于相邻的2个密码中，在转录翻译过程中互不相干，故从略。

图2 蒙古羊Hoxd11 exon-1及其氨基酸序列

3 讨论

在蒙古羊Hoxd11序列中，与Hoxc8的exon-1相似[5]，exon-1的CpG含量和分布密度大大高于exon-2。例如，Hoxd11 exon-1 CpG 的比例 30.85%（120×2/778），exon-2 CpG 的比例 10.17%（12×2/236）。Hoxd11 exon-1的 G+C含量为76.74%，高于A+T的含量（23.26%），其中CpG中的G+C含量30.85%。与Hoxc8 exon-1的碱基序列相似，Hoxd11 exon-1的碱基序列中，也没有可能导致Z-DNA构象的CpGpCpGp序列，或ACACACAC序列［6］，因此同样不存在具有免疫性或特异性很强的Z-DNA抗体［7］。由于小鼠的Hoxc8和Hoxd11基因的敲除实验证明，这两个基因调控胸腰椎的发育和数量变异，多胸椎（T14）与正常胸椎数（T13）的蒙古羊只在Hoxc8的exon-1序列的甲基化上存在差异，所以，可以推断，Hoxd11 exon-1的CpG甲基化的分布和数量差异，很可能是腰椎数量变异的原因。

由于DNA碱基序列中的甲基化胞嘧啶无论在三维结构上还是在分子轨道参数上，都没有达到改变DNA双螺旋结构或造成DNA复制障碍的程度，所以，胞嘧啶甲基化的生物学功能最有可能在DNA→RNA转录和翻译阶段起作用，即改变转录产物或翻译结果。甲基化胞嘧啶（5mC）分子的电子数比C分子多7个，所以5mC比C具有更高的电子密度，因此也具有比C更高的基态能量。基因的信息包括碱基的分子结构及其包含的电子信息和能量信息。这些信息具有稳定性和传递性，特异性和相干性，其表达与否，取决于来源父系还是母系。

在相同基因的同一密码中相同位置的胞嘧啶，其中一个未甲基化，另一个甲基化，在翻译过程中产生不同的氨基酸，这种差异用碱基结构差异无法解释，所以，必须从新的角度寻找其中的奥秘。密码和反密码配对时主要是碱基分子之间的3个氢键之间的结合，未参与这3个氢键形成的第5位的甲基究竟起了什么作用，这需要根据量子生物学知识，特别是胞嘧啶与甲基化胞嘧啶的分子轨道的多种能量系统的计算结果来确定。关于甲基化胞嘧啶的作用机理，目前，根据分子轨道理论计算结果［8］和甲基化序列分析［5］表明，一是取决于甲基化胞嘧啶分子处于基态还是处于激发态；二是胞嘧啶的甲基化是提高了还是降低了密码—反密码的相互识别标准；三是甲基化胞嘧啶在基因的第一外显子中的数量和排列的密集度；四是甲基化胞嘧啶位于第一外显子中的三联密码的第几个位置。这4种因素又决定了密码中的甲基化胞嘧啶与反密码识别的特异性，从而导致密码与反密码选择与胞嘧啶不同的氨基酸。

在掌握了蒙古羊Hoxd11 exon-1的CpG位点分布特征以后，下一步就是分析这些CpG中的甲基化位点，分布密度及其与蒙古羊多腰椎性状之间的关系。根据目前的实验结果（另文发表）可以预测，蒙古羊腰椎数（6个与7个）的差异，与Hoxd11 exon-1的CpG甲基化位点的数量和密度差异是相对应的。这种甲基化差异极有希望成为多腰椎个体的分子遗传标记，在早期选种中应用，成为提高肉羊产肉性能的新技术。

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［4］Burke A C，C E Nelson BA Morgan，C Tabin.Hox genes and the evolution of vertebrate axial morphology［J］.Development，1995，121:333-346.

［5］陈琦，赵静，张立岭.多脊椎蒙古羊Hoxc8 exon-1甲基化分析［J］.中国畜牧杂志，2009，45（23）：10-13.

［6］Wang A H J，Quigley G J，Kolapak F J，et al.Molecular structure of a left-handed DNA fragment at atomic resolution［J］.Nature，1979，282：680-686.

［7］Lafer E M，Moller A，et al.Antibody recognition of Z-DNA［J］.Cold Spring Harbor Symp Quant Biol，1983,47:155-162.

［8］刘次全.量子生物学及其应用［M］.北京：高等教育出版社，1990.