丙泊酚对大鼠肺缺血再灌注损伤细胞凋亡及相关蛋白的影响

付笑飞 赵 松 刘东雷 王建军 (华中科技大学同济医学院附属协和医院,湖北 武汉 430022)

在肺缺血再灌注损伤(lung ischemia reperfusion injury,LIRI)的过程中细胞凋亡是导致肺组织损伤的重要原因之一〔1〕。丙泊酚(propofol)是临床常用的静脉麻醉药,已有研究表明其对 LIRI有一定的保护作用〔2〕,但其机制尚不完全清楚。本研究通过建立大鼠在体 LIRI模型,观察丙泊酚对 LIRI肺细胞凋亡及相关蛋白的影响,并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料及实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠 42只,体重250～300 g(同济医学院动物饲养中心提供)。主要试剂:鼠抗Bcl-2、Bax抗体(Santa Cruz公司,美国)、原位细胞凋亡检测(TUNEL)试剂(Roche公司,德国)、二步法免疫组化检测试剂(PV-6001)(北京中杉金桥生物科技有限公司)。主要药物:丙泊酚注射液(Astra Zeneca公司,意大利)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制备 实验动物随机分为 3组,每组14只,分别为:假手术组(S组),除不作缺血处理外,余同其他组;肺缺血再灌注组(IR组),缺血 1 h,再灌 3 h;丙泊酚组(P组),缺血前 30 min静脉输注丙泊酚 5 mg/kg◦h-1,缺血 1 h,再灌 3 h。IR组和P组每组又分为两个亚组,再灌时间分别为1、3 h,每个亚组 7只大鼠。

实验前 4h禁食,腹腔注射4%戊巴比妥 50mg/kg麻醉后,仰卧位固定。行颈部气管切开、插管,并游离右侧颈静脉和颈动脉。接动物呼吸机行机械通气维持呼吸,右侧经静脉插管、固定,接微量注射泵;然后左侧第 5肋间开胸,钝、锐性结合游离左肺门。静息 5 min后,于呼气末用无创血管夹阻断左左主支气管、左肺动脉和左肺静脉。阻断 1 h后开放,进行再灌注1、3 h。于 1、3h实验结束时结扎肺门取出左肺待用。

1.2.2 肺组织Bcl-2、Bax蛋白检测 采用二步免疫组织化学法(PV)法检测 Bcl-2、Bax蛋白的表达情况。各组标本用 10%甲醛固定,石蜡包埋切片,严格按照免疫组织化学试剂盒进行操作,阳性标准为细胞质染色呈棕色,阴性对照组用 PBS代替一抗。在显微镜下观察,每张切片随机选取 5个视野,使用MIAS-2000图像分析系统分析阳性区域平均光密度值(OD),以OD值大小代表阳性产物表达的多少。

1.2.3 原位细胞凋亡检测 用TUNEL法检测细胞凋亡情况。光镜下观察细胞核染为棕黄色为凋亡细胞。每例标本的切片随机选取 5个高倍镜视野(40×10),按凋亡指数(AI)=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%计算。

1.2.4 肺组织病理学检测 4%多聚甲醛固定 24h,常规石蜡包埋、切片、HE染色,光镜下(×200)进行观察。

1.3 统计学处理 数据均采用 SPSS13.0软件分析,数据以x±s表示,组间比较采用 t检验和单因素方差分析。

2 结 果

2.1 肺组织 Bcl-2、Bax蛋白表达及 Bcl-2/Bax比值变化 与 S组相比,IR组、P组肺组织 Bcl-2、Bax蛋白含量均明显增加(P＜0.05);与 IR组相比,P组 Bcl-2蛋白表达明显增加,Bax表达减少(P＜0.05),见表 1。

表1 再灌注后不同时相Bcl-2、Bax蛋白(OD值)及 Bcl-2/Bax比值变化(x±s)

2.2 肺细胞凋亡指数(AI)变化 与 S组相比,IR组、P组肺AI值均明显增加(P＜0.05);与IR组相比,P组各时相 AI值减少,差异有统计学意义(P＜0.05)。IR组、P组各组内各时相均以再灌注 3h时 AI值最高,见表 2。

表2 再灌注后不同时相肺细胞AI值变化(x±s)

2.3 肺组织病理学检查 光镜下观察 HE染色病理切片,S组肺组织结构完好,肺泡腔完整,无明显渗出。水肿及炎性细胞浸润;IR组肺泡壁明显增厚,肺泡腔缩窄,可见大量炎症细胞浸润;P组肺组织病理改变较IR组轻,表现为肺泡壁轻度水肿及增厚,肺泡内可见中性粒细胞浸润。

3 讨 论

LIRI可发生于多种临床情况,是肺移植早期和心肺转流术后肺功能障碍的重要原因之一,而在LIRI发生过程中,由于细胞内活性氧增加、钙稳态失调及持续的低 pH等多种诱因,导致肺泡上皮细胞凋亡从而使肺功能受损。研究表明,Bcl-2和Bax是细胞凋亡相关基因中的重要成员,Bcl-2是主要的抑凋亡基因,它主要通过阻止线粒体内细胞色素 C的释放、抑制 caspase-3激活来阻止细胞凋亡〔3〕;Bax是 Bcl-2的同源体,其作用是通过抑制 Bcl-2来促进细胞凋亡〔4〕,Bcl-2/Bax的比例关系与细胞凋亡的调控密切相关〔5〕。本研究中观察到 IR组、P组肺细胞AI值与 S组相比明显增加(P＜0.05),证实了细胞凋亡在LIRI中起到重要作用。与 IR组相比,P组可明显增强肺组织 Bcl-2蛋白的表达,降低Bax蛋白的表达,使 Bcl-2/Bax比值增加而细胞凋亡指数降低,说明丙泊酚可能是通过调节Bcl-2/Bax途径来抑制 LIRI。

丙泊酚是一种新型的酚类静脉麻醉药,其化学成分为 2,6-二异丙基酚,大量研究显示其对缺血再灌注损伤有一定的保护作用,这种作用可能与其清除自由基的抗氧化作用有关〔6〕。本研究中病理切片观察到给予丙泊酚后肺组织水肿及炎性渗出较IR组明显减轻,说明丙泊酚可以通过减轻肺水肿起到对肺组织缺血再灌注损伤的保护作用,这与徐咏梅等〔2〕的研究结论相一致。此外丙泊酚还可以通过调节细胞内钙离子平衡起到抗凋亡的作用〔7〕。

1 Cobelens PM,Putte BP,Kavelaars A,et al.Inflammatory consequences of lung ischemia-reperfusion injury and low-pressure ventilation〔J〕.J Surg Res,2009;153(2):295-301.

2 徐咏梅,薄玉龙,吕湘琪,等 .丙泊酚对大鼠肺缺血-再灌注损伤的影响〔J〕.临床麻醉学杂志,2007;23(9):756-8.

3 Park SE,Park C,Kim SH,et al.Korean red ginseng extract induces apoptosis and decreases telomerase activity in human leukemia cells〔J〕.J Ethnopharmacol,2009;121(2):304-12.

4 Garcia EJ,Lawson D,Cotsonis G,et al.Hepatocellular carcinoma and markers of apoptosis(Bcl-2,Bax,Bcl-x):prognostic significance〔J〕.Applied Immunohistochem Mol Morphol,2002;10(3):210-7.

5 Huang YC,Chuang LY,Hung WC.Mechanisms underlying nonsteroidal anti-inflammatory drug-induced p 27(Kip1)expression〔J〕.Mol Pharmacol,2002;62(6):1515-21.

6 Chen L,Gong Q,Xiao C.Effectsof propofol,midazolam and thiopental sodium on outcome and amino acids accumulation in focal cerebral ischemia-reperfusion in rats〔J〕.Chin Med J,2003;116(2):292-6.

7 曹江北,李云峰,米卫东,等 .丙泊酚对细胞内钙离子的调节〔J〕.国外医学◦药学分册,2002;19(5):293-6.