广西巴马壮族长寿老人 p16基因甲基化

陈文成 潘尚领 覃志坚 韦叶生 何印蕾 林伟雄

(右江民族医学院医学检验学院临床微生物学和免疫学教研室,广西 百色 533000)

人的寿命与环境因素和遗传因素均有很大的关系,其中恶性肿瘤是老年人易患的直接关系到寿限的疾病之一,而肿瘤的发生与机体的抑癌基因关系密切。p16基因是一种重要的抑癌基因,在细胞周期过程中扮演着非常重要的角色,p16基因缺失或突变已被证实是许多肿瘤发生的原因之一〔1〕。近年研究表明 p16基因与细胞衰老有着紧密的联系。本文旨在探讨健康巴马壮族长寿老人 p16基因甲基化程度,进一步揭示其与长寿的关系。

1 对象与方法

1.1 对象 长寿组 (LG)156例,年龄 90～105岁 (12名≥100岁),平均年龄 93.2岁,男 46例,女 110例。对照组 (CG)142例均为健康成年人,年龄 20～72岁,平均年龄34.8岁,男 57例,女 85例。研究对象均为居住在巴马县(主要是甲篆、凤凰、西山等乡镇)和东兰县 (主要是城关、长乐、武篆、三石等乡镇)的壮族人,据家谱均可逆查 8代以上。LG老人均为巴马县长寿研究所和东兰县老干局老龄办建档并长期随访的对象。CG为同一地理区域内无血缘关系、随机抽样的成年人,生活习惯及劳动条件与 LG组均基本相同。每个实验对象采静脉血 2 ml,加ACD抗凝,用经典的苯酚/氯仿抽提法提取白细胞 DNA〔2〕。用 TE溶液溶解DNA样本置 4℃待用。

1.2 主要试剂 引物设计参照文献〔3〕的报道,甲基化及非甲基化引物扩增片断长度分别是150 bp和 151 bp,由上海生工生物工程技术有限公司合成。p16甲基化引物序列:上游 5′-TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC-3′;下游 5′-GACCCCGAACCGCGACCGTAA-3′,p 16非甲基化引物序列:上游 5′-TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT-3′;下 游 5′-CAACCCCAAACCACAACCATAA-3′。 dNTPs、Taq DNA聚合 酶 (含 10 ×buffer、MgCl2)、小牛血清(BSA)、二甲亚砜(DMSO)等均为华美公司产品。DNA Marker为宕生物工程有限公司产品。琼脂糖为西班牙进口,由上海Yito Enterprise有限公司分装提供。

1.3 实验方法 按照 Herman等〔4〕描述的甲基化特异性 PCR(methylation specific PCR,MSP)方法,并参考文献 〔5〕进行 p16基因甲基化的检测,其原理是DNA双链变性解链后在亚硫酸氢钠作用下碱基C转化成U,但对于已发生甲基化的C则无此改变,据此设计两对不同引物进行 PCR扩增即可检测出此差异。步骤如下:①DNA修饰。取 50μl(2μg)经 TE溶液溶解 DNA样品,加入新配的 3 mol/L NaOH 5.5μl,42℃水浴 30min。加入新配的 10 mmol/L氢醌 30μl和 3.9 mol/L亚硫酸氢钠 (Sigma公司)510μl,加少许石蜡避光 55℃水浴16 h。②DNA纯化。采用Wizard DNA纯化系统 (Promega),将去针头的注射器针管固定于纯化柱上,将上述 DNA与 1ml纯化树脂混匀后转移至注射针管,加活塞轻推,同法用 2 ml 80%异丙醇洗涤 1次,14 000 r/min离心纯化柱2min。加50μl预热灭菌双蒸水于纯化柱 (65℃),室温放置 1 min,13 000 r/min离心2 min,弃纯化柱。加入 5μl新备的 3 mol/L NaOH,42℃水浴15 min,加入乙酸铵 (终浓度 3mol/L)、1μl糖原 (10 g/L)和三倍体积的无水乙醇,-20℃过夜。14 000 r/min 4℃离心20min,70%乙醇洗涤,加50μl双蒸水溶解备用。

1.3.1 PCR 反应体系为 25μl,每个反应体系分别加入上述两对引物;PCR反应条件为:94℃预变性 4 min→94℃变性1 min→59.8℃退火 1 min→72℃延伸 1 min,进行 33个循环反应。

1.3.2 电泳 基因扩增后以 8μl PCR反应产物在 2%琼脂糖凝胶上电泳,电流 45 mA,电压 100 V,电泳载样缓冲液为1×TBE缓冲液,电泳后,在紫外光透射仪上观察,摄片并记录结果。甲基化引物扩增有 150 bp条带说明该基因发生了甲基化,非甲基化引物扩增有 151 bp条带则说明该基因未发生甲基化。

1.4 统计学处理 长寿组和对照组的各基因频率比较分析用χ2检验,用 SPSS软件包进行分析。

2 结 果

LG组 p16基因甲基化率明显低于 GC组(P＜0.05)。对男女分别比较后,LG组 p16基因甲基化率亦明显低于 GC组(P＜0.05),见表 1。

表1 p16基因甲基化分布的长寿组与对照组比较〔n(%)〕

3 讨 论

抑癌基因与细胞衰老有着密切的关系,p16基因是目前研究较多的肿瘤抑制基因之一,其缺失与许多肿瘤有关〔6〕。p16属于 INK 4a/ARP位点的肿瘤抑制基因,位于染色体 9p21,其编码蛋白是 CDK4抑制物。近年研究表明 p16基因还与细胞衰老有着紧密联系,p16的大量失活是诱发细胞衰老及肿瘤的一个重要原因之一。研究表明,p16的主要作用是特异地抑制细胞周期素 D-细胞周期素依赖性交合体对细胞 G1期到 S期的调控,当其缺失或失活时,交合体则持续高活性的存在于细胞内导致 PRB基因的磷酸化,释放转录因子E2F等,激活多种细胞增殖的相关因子〔7〕,从而导致细胞 G1期到 S期的失控,细胞发生异常增殖,导致最后的恶变。

随着研究的深入,人们认识到基因的甲基化修饰同基因缺失、突变一样,也是肿瘤发生、发展和细胞衰老凋亡调节的重要因素。目前对 DNA甲基化的研究还处在起步阶段,DNA甲基化的发生原因及确切机制还有待于进一步研究。甲基化是p16基因失活的重要机制,p16基因 5-CpG岛甲基化已被证实与p 16的失活有密切的关系〔8〕。其机制可能与启动子区高甲基化导致的 p16基因沉默有关。

广西巴马县是著名的世界第五长寿之乡,国内很多学者对该地区的长寿人群进行了大量的研究〔9〕,但是关于遗传因素方面的研究很少。本研究表明,长寿组 p16基因甲基化比对照组低;对男女分别比较后,长寿组 p16基因甲基化比对照组低。而两组中女性 p16基因甲基化均比男性高,说明不同性别人群p 16基因甲基化程度是不一样的,研究衠明,长寿与性别之间存在相关关系,人类长寿显示明显的母系遗传倾向〔10〕。虽然女性的长寿与其生理特点、社会生活习惯及生活环境等有很密切的关系,但是,不可否认的是遗传因素在其中也起了很重要的作用。本研究结果提示 p16基因甲基化和不同性别的长寿人群有一定关系,可能正是由于长寿老人 p16基因甲基化率低,使得p 16基因失活少,从而减少患癌症等影响寿命的疾病的机会。由于遗传因素在体内的作用极其复杂,因此,要想弄清楚其在长寿中的具体作用机制并非一朝一夕的事,仍然需要作更进一步的研究。

p16基因甲基化与衰老的关系密切,对长寿人群体内这些基因的深入研究将有助于对抗衰老过程中抑制肿瘤发生的全面理解。另外,抗衰老过程中伴随着抑制肿瘤的机制,因此,对细胞衰老的研究也将为癌症的预防和治疗方法研究提供更为广阔的前景。

1 Esteller M,Corn PG,Baylin SB,et al.A gene hypermethylation profile of human cancer〔J〕.Cancer Res,2001;61(8):3225-9.

2 卢圣栋.现代分子生物学实验技术〔M〕.第 2版.北京:中国协和医科大学出版社,1993:108.

3 Kim YS,Kim JS,Jung HC,et al.Regression of low-grade gastric mucosaassociated lymphoid tissue lymphoma after eradication of Helicobacter pylori:possible association with p16 hypermethylation〔J〕.J Gastroenterol,2002;37(1):17-22.

4 Herman JG,Graff JR,Myohanen S,et al.Methylation-specific PCR:a novel PCR assay for methylation status of CpG islands〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1996;93(18):9821-6.

5 刘晓颖,汪惠园,鲁 云,等 .p16基因甲基化特异检测方法的建立及其初步应用〔J〕.安徽医科大学学报,2002;37(1):18-21.

6 Warltatmbe T,Nakamura M,Yonekawa Y,et al.Promoter hypermethylation and homozygous deletion of the p19ARFand p 16INK4a genes in oligodendrogliomas〔J〕.Act Neuro pathol,2001;101(3):185.

7 Ahmad T,Gore M.Review of the use of topotecan in ovarian carcinoma〔J〕.Expert Opin Pharmacother,2004;5(11):2333-40.

8 Kang GH,Lee S,Kim JS,et al.Profile of aberrant CpG island methylation along the multistep pathway of gastric carcinogenesis〔J〕.Lab Invest,2003;83(5):635.

9 余祥美.巴马县 29名高龄老人细胞遗传学分析〔J〕.中华老年医学杂志,1982;1(20):70-3.

10 Perls T,Kunkel L,Puca A.The genetics of aging〔J〕.Curr Opin Genet Dev,2002;12(3):362-9.